Протеїназа K NGS (порошок)
Каталожний номер: HC4507A
NGS Protease K — це стабільна серин-протеаза з високою ферментативною активністю та широкою субстратною специфічністю. Фермент переважно розщеплює складноефірні та пептидні зв’язки, розташовані поруч із С-кінцем гідрофобних амінокислот, сірковмісних амінокислот і ароматичних амінокислот.Тому його часто використовують для розкладання білків на короткі пептиди.NGS протеаза К є типовою сериновою протеазою з Asp39-Його69-Сер224каталітична тріада, яка є унікальною для серинових протеаз, і каталітичний центр оточений пучком Са2+сайти зв'язування для стабілізації, підтримання високої активності ферменту в більш широкому діапазоні умов.
Специфікація
| Зовнішній вигляд | Білий або майже білий аморфний порошок, ліофілізований |
| Конкретна діяльність | ≥40U/мг твердої речовини |
| ДНКаза | Не виявлено |
| РНКаза | Не виявлено |
| Біонавантаження | ≤50 КУО/г твердої речовини |
| Залишок нуклеїнової кислоти | <5 пг/мг твердої речовини |
Властивості
| Джерело | Tritirachium album |
| номер EC | 3.4.21.64(Рекомбінант з Tritirachium album) |
| Молекулярна вага | 29 кДа (SDS-PAGE) |
| Ізоелектрична точка | 7.81 Рис.1 |
| Оптимальний pH | 7,0-12,0 (Всі проявляють високу активність) Рис.2 |
| Оптимальна температура | 65℃ Рис.3 |
| Стабільність pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 год) Рис.4 |
| Термостабільність | Нижче 50 ℃ (pH 8,0, 30 хвилин) Рис.5 |
| Стійкість при зберіганні | Зберігається при 25 ℃ протягом 12 місяців Рис.6 |
| активатори | SDS, сечовина |
| інгібітори | диізопропілфторфосфат;бензилсульфонілфторид |
Умови зберігання
Зберігайте ліофілізований порошок при -25 ~ -15 ℃ протягом тривалого часу подалі від світла;Після розчинення розподіліть у відповідний об’єм для короткочасного зберігання при 2-8 ℃ подалі від світла або тривалого зберігання при -25~-15 ℃ подалі від світла.
Запобіжні заходи
Одягайте захисні рукавички та окуляри під час використання або зважування та добре провітрюйте після використання.Цей продукт може викликати шкірну алергічну реакцію та серйозне подразнення очей.При вдиханні це може викликати симптоми алергії або астми або задишку.Може викликати подразнення дихальних шляхів.
Визначення одиниці
Одна одиниця NGS Protease K визначається як кількість ферменту, необхідного для гідролізу казеїну в 1 мкмоль L-тирозину за стандартних умов визначення.
Приготування реактивів
| Реагент | Виробник | Каталог |
| Казеїн технічнийз бичачого молока | Сігма Олдріч | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2 год2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Трихлороцтова кислота | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Ацетат натрію | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Оцтова кислота | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Карбонат натрію | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Фолін-фенол | Sangon Biotech (Шанхай)Лтд. | A500467-0100 |
| L-тирозин | Сигма | 93829 |
Реагент I:
Субстрат: 1% казеїну з розчину бичачого молока: розчиніть 1 г казеїну бичачого молока в 50 мл 0,1 М розчину фосфату натрію, рН 8,0, нагрійте на водяній бані при 65-70 °C протягом 15 хвилин, перемішайте та розчиніть, охолодіть водою, відрегулювавши гідроксиду натрію до pH 8,0 і розведіть до 100 мл.
Реагент II:
Розчин TCA: 0,1 М трихлороцтової кислоти, 0,2 М ацетату натрію та 0,3 М оцтової кислоти (послідовно зважте 1,64 г трихлороцтової кислоти + 1,64 г ацетату натрію + 1,724 мл оцтової кислоти, додайте 50 мл деіонізованої води, доведіть HCl до рН 4,03 і розведіть до 100 мл).
Реагент III:
0,4 мл розчину карбонату натрію (зважте 4,24 г безводного карбонату натрію та розчиніть у 100 мл води)
Реагент IV:
Фолінофенольний реагент: розвести в 5 разів деіонізованою водою.
Реагент V:
Розчинник ферменту: 0,1 М розчин натрію фосфату, рН 8,0.
Реагент VI:
Стандартний розчин L-тирозину: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 мкмоль/мл L-тирозину, розчиненого в 0,2 М HCl.
Процедура
1. Увімкніть спектрофотометр UV-Vis і виберіть фотометричне вимірювання.
2. Встановіть довжину хвилі 660 нм.
3. Увімкніть водяну баню, встановіть температуру 37℃, тримайте температуру незмінною протягом 3-5 хвилин.
4. Попередньо нагрійте 0,5 мл субстрату в центрифужній пробірці на 2 мл на водяній бані при 37 ℃ протягом 10 хвилин.
5. Екстрагуйте 0,5 мл розведеного розчину ферменту в попередньо нагріту центрифужну пробірку протягом 10 хвилин.Встановіть ферментний розчинник як порожню групу.
6. Додайте 1,0 мл реагенту TCA одразу після реакції.Добре перемішайте і витримайте на водяній бані 30 хвилин.
7. Центрифугувати реакційний розчин.
8. Додайте наступні компоненти у вказаному порядку.
| Реагент | Обсяг |
| Супернатант | 0,5 мл |
| 0,4 М Карбонат натрію | 2,5 мл |
| Фолінфенольний реактив | 0,5 мл |
9. Добре перемішайте перед інкубацією на водяній бані при 37 ℃ протягом 30 хвилин.
10. ОД660визначався як OD1;порожня контрольна група: ферментний розчинник використовується замість розчину ферменту для визначення OD660як OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Стандартна крива L-тирозину: 0,5 мл розчину L-тирозину різної концентрації, 2,5 мл 0,4 М карбонату натрію, 0,5 мл фенолового реагенту фоліну в центрифужній пробірці на 5 мл, інкубувати при 37 ℃ протягом 30 хвилин, визначити OD660для різних концентрацій L-тирозину, тоді отримано стандартну криву Y=kX+b, де Y — концентрація L-тирозину, X — OD600.
Розрахунок
2: Загальний об'єм реакційного розчину (мл)
0,5: Об’єм розчину ферменту (мл)
0,5: Об’єм реакційної рідини, що використовується для хромогенного визначення (мл)
10: Час реакції (хв)
Df: Багаторазове розведення
C: Концентрація ферменту (мг/мл)
Цифри
Рис.1 Залишок ДНК
| Зразок | просп C4 | Нуклеїнова кислота Відновлення (пг/мг) | Відновлення (%) | Загальний нуклеїновий Кислота ( пг/мг) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83% | 2,687 |
| PRK+STD2 | 18,723 | 126,728 | — | — |
| STD1 | 12,955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23,135 | |||
| STD5 | 26,625 | |||
| H2O без РНК | Невизначений | — | — | — |
Рис.2 Оптимальний pH
Рис.3 Оптимальна температура
Рис.4 Стабільність pH
Рис.5 Термічна стабільність
Рис.6 Стабільність при зберіганні при 25 ℃
