EndoFree Plasmid Maxi Kit

Умови зберігання

РНКазу слід зберігати при -30 ~ -15 ℃ і транспортувати при ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger можна зберігати при 2 ~ 8 ℃ протягом одного місяця, зберігати при -30 ~ -15 ℃ для тривалого зберіганняі транспортується при ≤0 ℃.

Інші компоненти слід зберігати при кімнатній температурі (15 ~ 25 ℃) і транспортувати при кімнатній температурі.

компоненти

РНКаза A:10 мг/мл, використовується для видалення РНК.

Буфер P1:бактеріальний суспензійний буфер, додайте РНКазу A до буфера P1 перед першим використанням.

Буфер P2:буфер для бактеріального лізису (містить SDS/NaOH).

Буфер P4:нейтралізуючий буфер.

Поглинач ендотоксинів:ефективно видаляти ендотоксин із сирого екстракту плазміди.

Буфер PW:промивний буфер, додайте зазначений об’єм етанолу перед першим використанням.

Буферний ТБ:буфер для елюції.

Колонки FastPure DNA Maxi:адсорбційні колонки плазмідної ДНК.

Пробірки для збору 50 мл:пробірки для збору фільтрату.

Пробірка для збору без ендотоксинів:пробірки для збору плазмідної ДНК.

Підготовлені матеріали

Абсолютний етанол, ізопропанол, центрифужні пробірки з круглим дном на 50 мл і 50 мл без ендотоксинівцентрифужні пробірки.

Додатки

Цей продукт підходить для великомасштабної екстракції плазмід з 150 - 300 мл бактеріального розчину.культивували протягом ночі.

Процес експерименту

1. Візьміть 150 – 200 мл (не більше 300 мл) бактеріального розчину, культивованого протягом ночі, і центрифугуйте приприблизно 11 000 об/хв (12 000 × g) протягом 1–2 хв.Викиньте супернатант і зберіть бактерії.

Δ При зборі більше ніж 50 мл бактеріального розчину, бактерії можна зібрати шляхом додавання бактеріального розчину, центрифугування, відкидання супернатанту та інших кроків у ту саму 50 мл пробірку для

кілька разів.

2. Додайте 7,5 мл буфера P1 (перевірте, чи була додана РНКаза A до буфера P1) у центрифугупробірку з бактеріями та ретельно перемішайте вортексом або піпеткою.

Δ Повне ресуспендування бактерій на цьому етапі має вирішальне значення для отримання виходу, і після ресуспендування не повинно бути бактеріальних згустків.Якщо є бактеріальні згустки, які не ретельно перемішані, це вплине на лізис, що призведе до низького виходу та чистоти.Якщо OD600 розчину бактерій становить 0,65, рекомендується використовувати 7,5 мл буфера P1 при екстракції з 150 мл розчину бактерій;коли OD600 становить 0,75, слід використати 8 мл буфера P1 і відповідно змінити об’єми буферів P2 і P4.При збільшенні об’єму бактеріального розчину до 200 мл рекомендуєтьсяоб’єм буферів P1, P2 і P4 потрібно збільшити пропорційно.

3. Додайте 7,5 мл буфера P2 до бактеріальної суспензії з кроку 2 і обережно перемішуйте протягом 6–8разів та інкубуйте при кімнатній температурі 4–5 хв.

Δ Обережно переверніть, щоб ретельно перемішати.Вортексування призведе до фрагментації геномної ДНК, що призведе до утворення фрагментів геномної ДНК у витягнутій плазміді.У цей час розчин стає в’язким і напівпрозорим, що свідчить про повний лізис бактерій.Тривалість не повинна перевищувати 5 хв, щоб уникнути руйнування плазмід.Якщо розчин непрозорий, це може призвести до забагато бактерійнеповний лізис, тому кількість бактерій слід відповідно зменшити.

4. Додайте 7,5 мл буфера P4 до бактеріальної суспензії з кроку 3 і негайно обережно переверніть 6-8 разів, щоб дозволити розчину повністю нейтралізувати буфер P2.У цей час повинен випасти білий пластівчастий осад.Центрифугуйте зі швидкістю понад 11 000 об/хв (12 000 × g) протягом 10–15 хвилин, обережно внесіть піпеткою супернатант у нову центрифужну пробірку з круглим дном об’ємом 50 мл (приготовану самостійно) і уникайтеаспіруйте плаваючий білий осад.

Δ Додайте буфер P4 і негайно переверніть, щоб добре перемішати.Залиште пробірку стояти, доки білий осад не розподілиться рівномірно по всьому розчину, щоб запобігти утворенню локального осаду, який може вплинути на нейтралізацію.Якщо перед центрифугуванням немає рівномірного білого пластівчастого осаду, а супернатант не прозорий після центрифугування, пробірку можнацентрифугують ще 5 хв.

5. Додайте 0,1 об’єму (10% об’єму надосадової рідини, приблизно 2,2 мл) засобу для поглинання ендотоксинів до надосадової рідини з кроку 4 та переверніть для перемішування.Помістіть розчин у крижану баню або помістіть у колотий лід (або морозильну камеру холодильника) на 5 хвилин, доки розчин не зміниться з каламутного на чистий і прозорий (або не зміниться).злегка каламутним) і час від часу перемішуйте кілька разів.

Δ Після додавання поглинача ендотоксинів до супернатанту супернатант стане каламутним, алесупернатант має стати прозорим (або злегка каламутним) після охолодження на крижаній бані.

6. Після того, як надосадову рідину помістять при кімнатній температурі (>25 ℃) на 10–15 хвилин, вона стане каламутною, оскількийого температура підвищується до кімнатної.Потім супернатант слід перевернути для перемішування.

Δ Якщо кімнатна температура нижча або ви хочете скоротити час екстракції, супернатант можна інкубувати у водяній бані при 37 ~ 42 ℃ протягом 5–10 хвилин, а наступний крок можна виконати після супернатанту.стає каламутним.

7. Центрифугуйте супернатант при приблизно 11 000 об/хв (12 000 × g) протягом 10 хвилин при кімнатній температурі (температура має бути >25 ℃), щоб розділити фазу.Верхня водна фаза містить ДНК, тоді як нижній блакитний масляний шар містить ендотоксин та інші домішки.ПередайтеДНК-вмісну водну фазу в нову пробірку тавідмовтеся від жирного шару.

Δ Температура під час центрифугування має бути вище 25 ℃, оскільки ефективне розділення фаз не відбуваєтьсявиникає, якщо температура занадто низька.

Δ Якщо розділення фаз неефективне, температуру центрифугування можна відрегулювати до 30 ℃ ічас центрифугування можна збільшити до 15 хв.

Δ Не висмоктуйте синій жирний шар, оскільки він містить ендотоксин та інші домішки.

Механізм

Ресуспензія Лізис Нейтралізація

◇ Додайте 7,5 мл буфера P1

◇ Додайте 7,5 мл буфера P2

◇ Додайте 7,5 мл буфера P4

Видалення ендотоксину

◇ Додайте 0,1 об’єму супернатанту Endotoxin Scavenger

Палітурка та прання

◇ Додайте 0,5 об’єму ізопропанолу

◇ Додайте 10 мл буфера PW