Зворотна транскриптаза RTL
Зворотна транскриптаза RTL є залежною від РНК-матриці ДНК-полімеразою, яка не має екзонуклеазної активності 3'→5' і має активність РНКази H.Цей фермент може використовувати РНК як матрицю для синтезу комплементарного ланцюга ДНК, який можна застосовувати для синтезу кДНК першого ланцюга, особливо для RT-LAMP (ізотермічна ампліфікація, опосередкована петлею).Порівняно зі зворотною транскриптазою RTL 1.0 чутливість значно покращена, термостабільність сильніша, а реакція при 65°C більш стабільна.Зворотну транскриптазу RTL (без гліцерину) можна використовувати для приготування ліофілізованих препаратів, ліофілізованих реагентів RT-LAMP тощо.
Визначення одиниці
Одна одиниця включає 1 нмоль dTTP у матеріал, що осаджується кислотою, протягом 20 хвилин при 50°C з використанням полі(А)•оліго(дТ)25 як шаблону-праймера.
компоненти
| компонент | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Зворотна транскриптаза RTL (без гліцерину) (15 ОД/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 10 мл |
| 10×HC RTL буфер | 1,5 мл | 4×1,5 мл | 5×10 мл |
| MgSO4 (100 мМ) | 1,5 мл | 2×1,5 мл | 3×10 мл |
Умови зберігання
Транспортувати при температурі до 0°C і зберігати при -25°C~-15°C.
Контроль якості
- Залишкова активністьEндонуклеаза:Реакція об’ємом 50 мкл, що містить 1 мкг λДНК і 15 одиниць RTL2.0, інкубована протягом 16 годин при 37 ℃, демонструє таку саму картину, як і негативний контроль за допомогою електрофорезу в гелі.
- Залишкова активністьЕкзонуклеаза:Реакція об’ємом 50 мкл, що містить 1 мкг λДНК, розщепленої Hind Ⅲ, і 15 одиниць RTL2.0, інкубована протягом 16 годин при 37 ℃, демонструє таку саму картину, як негативний контроль за допомогою електрофорезу в гелі.
- Залишкова активністьNickase:Реакція об’ємом 50 мкл, що містить 1 мкг суперскрученого pBR322 і 15 одиниць RTL2.0, інкубована протягом 4 годин при 37°C, демонструє таку саму картину, як негативний контроль за допомогою гель-електрофорезу.
- Залишкова активністьРНКаза:10 мкл реакції, що містить 0,48 мкг MS2 РНК і 15 одиниць RTL2.0, інкубованих протягом 4 годин при 37 °C, демонструють таку саму картину, як негативний контроль за допомогою електрофорезу в гелі.
- кишкова паличка gДНК:Вимірюється сE.coliспеціальні комплекти виявлення HCD, 15 одиниць RTL2.0 містять менше 1кишкова паличкагеном.
Налаштування реакції
Протокол синтезу кДНК
| компоненти | Обсяг |
| Матрична РНК а | необов'язковий |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) або довільна суміш праймерів (60uM) | 2 мкл |
| Суміш dNTP (10 мМ кожен) | 1 мкл |
| Інгібітор РНКази (40U/мкл) | 0,5 мкл |
| Зворотна транскриптаза RTL 2.0 (15 од./мкл) | 0,5 мкл |
| 10×HC RTL буфер | 2 мкл |
| Вода без нуклеаз | До 20 мкл |
Примітки:
1) Рекомендована доза загальної РНК становить 1 нг~1 мкг
2) Рекомендована доза мРНК становила 50 нг ~ 100 нг
Термо-їзда на велосипеді Умови для рутини реакція:
| Температура (°C) | час |
| 25 °Ca | 5 хв |
| 55 °C | 10 хвb |
| 80 °C | 10 хв |
Примітки:
1) Якщо використовується Random Primer Mix, етап інкубації при 25°C.
2) Якщо використовується цільова суміш праймерів, етап інкубації при 55°C протягом 10~30 хвилин.
Протокол RT-LAMP
| компоненти | Обсяг | Остаточна концентрація |
| Матрична РНК | необов'язковий | ≥10 примірників |
| Суміш dNTP (10 мМ) | 3,5 мкл | 1,4 мМ |
| Праймери FIP/BIP (25×) | 1 мкл | 1,6 мкМ |
| F3/B3 Праймери (25×) | 1 мкл | 0,2 мкМ |
| Праймери LoopF/LoopB (25×) | 1 мкл | 0,4 мкМ |
| Інгібітор РНКази (40U/мкл) | 0,5 мкл | 20 U/Реакція |
| Зворотна транскриптаза RTL 2.0 (15 од./мкл) | 0,5 мкл | 7,5 U/реакція |
| Bst V2 ДНК-полімераза (8U/мкл) | 1 мкл | 8 U/Реакція |
| MgSO4 (100 мМ) | 1,5 мкл | 6 мМ (всього 8 мМ) |
| Буфер 10×HC RTL (або буфер 10×HC Bst V2) | 2,5 мкл | 1 × (2 мМ Mg2+) |
| Вода без нуклеаз | До 25 мкл | - |
Примітки:
1) Перемішайте за допомогою вортексу та ненадовго відцентрифугуйте, щоб зібрати.Інкубація при постійній температурі при 65°C протягом 1 години.
2) Два буфери взаємодіють і мають однаковий склад.
Примітки
1. Цей продукт утворює білу тверду речовину при зберіганні при -20 °C.Вийміть його з -20°C і покладіть на лід приблизно на 10 хвилин.Після розплавлення його можна використовувати, струшуючи та перемішуючи.
2. Продукт кДНК можна зберігати при -20°C або -80°C або негайно використовувати для реакції ПЛР.
3. Щоб запобігти забрудненню РНКазою, тримайте експериментальну зону в чистоті та надягайте чисті рукавички та маски під час роботи.
