Протеїназа K mNGS (рідина)
Протеїназа К є стабільною сериновою протеазою з широкою субстратною специфічністю.Він розкладає багато білків у нативному стані навіть у присутності миючих засобів.Дані досліджень кристалічної та молекулярної структури вказують на те, що фермент належить до сімейства субтилізину з каталітичною тріадою активного центру (Asp39-Його69-Сер224).Переважним місцем розщеплення є пептидний зв'язок, що примикає до карбоксильної групи аліфатичних і ароматичних амінокислот із заблокованими альфа-аміногрупами.Він зазвичай використовується через широку специфіку.Ця протеїназа K спеціально розроблена для mNGS.Порівняно з іншою протеїназою K, вона містить навіть менше забруднення нуклеїновими кислотами з тією самою ферментативною ефективністю, що може краще забезпечити подальше застосування mNGS.
Умови зберігання
2-8 ℃ протягом 2 років
Специфікація
| Зовнішній вигляд | Безбарвна або світло-коричнева рідина |
| діяльність | ≥800 Од/мл |
| Концентрація білка | ≥20 мг/мл |
| Nickase | Не виявлено |
| ДНКаза | Не виявлено |
| РНКаза | Не виявлено |
Властивості
| номер EC | 3.4.21.64(Рекомбінант з Tritirachium album) |
| Ізоелектрична точка | 7.81 |
| Оптимальний pH | 7,0- 12,0 Рис. 1 |
| Оптимальна температура | 65 ℃ Рис. 2 |
| Стабільність pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 год) Рис. 3 |
| Термостабільність | Нижче 50 ℃ (рН 8,0, 30 хв) Рис. 4 |
| Стійкість при зберіганні | Понад 90% активності протягом 12 місяців при 25 ℃ |
| активатори | SDS, сечовина |
| інгібітори | диізопропілфторфосфат;фенілметилсульфонілфторид |
Додатки
1. Набір для генетичної діагностики
2. Набори для виділення РНК і ДНК
3. Екстракція небілкових компонентів із тканин, деградація білкових домішок, таких як ДНКвакцини і препарат гепарину
4. Отримання хромосомної ДНК методом імпульсного електрофорезу
5. Вестерн-блот
6. Ферментативні глікозильовані альбумінові реагенти in vitro діагностика
Запобіжні заходи
Одягайте захисні рукавички та окуляри під час використання або зважування та добре провітрюйте після використання.Цей продукт може викликати шкірну алергічну реакцію та серйозне подразнення очей.При вдиханні це може викликати симптоми алергії або астми або задишку.Може викликати подразнення дихальних шляхів.
Визначення одиниці
Одна одиниця (U) визначається як кількість ферменту, необхідного для гідролізу казеїну для отримання 1 мкмольтирозину за хвилину за таких умов.
Приготування реактивів
Реагент I: 1 г молочного казеїну розчиняють у 50 мл 0,1 М розчину фосфату натрію (рН 8,0), інкубують у воді при 65-70 ℃ протягом 15 хвилин, перемішують і розчиняють, охолоджують водою, доводять рН гідроксидом натрію до 8,0 і фіксують об’єм. 100 мл.
Реагент II: 0,1 М трихлороцтової кислоти, 0,2 М ацетату натрію, 0,3 М оцтової кислоти.
Реагент III: 0,4 М Na2CO3рішення.
Реактив IV: реактив форинта, розбавлений чистою водою в 5 разів.
Реагент V: ферментний розчинник: 0,1 М розчин фосфату натрію (pH 8,0).
Реагент VI: розчин тирозину: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 мкмоль/мл тирозину, розчиненого в 0,2M HCl.
Процедура
1. 0,5 мл реагенту I попередньо нагрівають до 37 ℃, додають 0,5 мл розчину ферменту, добре перемішують та інкубують при37 ℃ протягом 10 хв.
2. Додайте 1 мл реагенту II, щоб зупинити реакцію, добре перемішайте та продовжуйте інкубацію протягом 30 хвилин.
3. Центрифугувати реакційний розчин.
4. Візьміть 0,5 мл супернатанту, додайте 2,5 мл реагенту III, 0,5 мл реагенту IV, добре перемішайте та інкубуйте при 37 ℃протягом 30 хв.
5. ОД660визначався як OD1;порожня контрольна група: 0,5 мл реагенту V використовують для заміни ферментурозчин для визначення ОД660як OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Стандартна крива L-тирозину: 0,5 мл розчину L-тирозину різної концентрації, 2,5 мл реагенту III, 0,5 мл реагенту IV у центрифужній пробірці на 5 мл, інкубувати при 37 ℃ протягом 30 хвилин, визначити OD660для різних концентрацій L-тирозину, потім отримано стандартну криву Y=kX+b, де Y — концентрація L-тирозину, X — OD600.
Розрахунок
2: Загальний об'єм реакційного розчину (мл)
0,5: Об’єм розчину ферменту (мл)
0,5: Об’єм реакційної рідини, що використовується для хромогенного визначення (мл)
10: Час реакції (хв)
Df: Багаторазове розведення
C: Концентрація ферменту (мг/мл)
Список літератури
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.біофіз.рез.Комун.(1971);44:513.
3. Гільц Х.та ін.,Євро.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Сембрук Джet ін., Молекулярне клонування: Лабораторний посібник, 2-е видання, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Цифри
Рис.1 Оптимальний pH
100 мМ буферний розчин: рН 6,0-8,0, Na-фосфат;pH8,0-9,0, трис-HCl;pH9,0-12,5, гліцин-NaOH. Концентрація ферменту: 1 мг/мл
Рис.2 Оптимальна температура
Реакція в 20 мМ К-фосфатному буфері рН 8,0.Концентрація ферменту: 1 мг/мл
Рис.3 pH Стабільність
25 ℃, 16 годин - обробка 50 мМ буферним розчином: pH 4,5-5,5, ацетат;pH 6,0-8,0, Na-фосфат;pH 8,0-9,0, трис-HCl.pH 9,0-12,5, гліцин-NaOH.Концентрація ферменту: 1 мг/мл
Рис.4 Теплові стабільність
30-хвилинна обробка 50 мМ Tris-HCl буфером, pH 8,0.Концентрація ферменту: 1 мг/мл
Рис.5 Зберігання стабільніty at 25℃
