2×Sensi Direct Premix-UNG (зонд qPCR)
Каталожний номер: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) призначений для проведення ПЛР безпосередньо зі зразків без екстракції ДНК або підготовки зразків.Цей реагент складається з ДНК-полімерази гарячого старту, урацил-ДНК-глікозилази (UNG), інгібітора РНКази, MgCl2, dNTP (з dUTP замість dTTP) і стабілізатори для кількісної ПЛР (qPCR).Цей реагент забезпечує високу толерантність до інгібіторів, тому його можна безпосередньо застосовувати для виявлення зразків, таких як мазок із горла, слина, антикоагулянтна цільна кров, плазма та сироватка без екстракції ДНК.Реагент використовує запатентований буфер для кПЦР зі змішаними ферментами антиінгібіторної ДНК-полімерази та ферменту UNG.Таким чином, він може отримати хорошу ампліфікацію цільових генів у зразках, що містять інгібітори, і пригнічувати хибнопозитивну ампліфікацію, спричинену залишками ПЛР та аерозольним забрудненням.Цей реагент сумісний з більшістю флуоресцентних приладів для кількісної ПЛР, таких як Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche тощо.
компоненти
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. Буфер попереднього змішування 2×SensiDirect (dUTP)
Умови зберігання
Всі компоненти повинні зберігатися при -20 ℃ для тривалого зберігання та 4 ℃ до 3 місяців.Будь ласка, ретельно перемішайте після розморожування та відцентрифугуйте перед використанням.Уникайте частого заморожування-розморожування.
Велосипедний протокол
| Крок | Температура | час | Цикл |
| Травлення | 50 ℃ | 2 хв | 1 |
| Активація полімерази | 95 ℃ | 1-5 хв | 1 |
| Денатурація | 95 ℃ | 10-20с | 40-50 |
| Відпал/Нарощування | 56-64 ℃ | 20-60-ті роки |
Інструкція з дозування
| Реагент | Обсяг на реакція | Об'єм на реакцію | Остаточна концентрація |
| 2 × буфер попереднього змішування SensiDirect (dUTP) | 12,5 мкл | 25 мкл | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 мкл | 1 мкл | 1× |
| 25 × Суміш праймер-зонд1, 2 | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| Зразок3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Загальний обсяг | 25 мкл | 50 мкл | - |
1. Кінцева концентрація праймера зазвичай становить 0,2 мкМ.Для кращих результатів концентрацію праймера можна оптимізувати в межах 0,2-1 мкМ.
2. Як правило, концентрацію зонда можна оптимізувати в діапазоні 0,1-0,3 мкМ.Оптимальна концентрація зонда залежить від приладу ПЛР-ампліфікації в реальному часі, типу зонда та типу флуоресцентної речовини для мічення.Будь ласка, зверніться до посібника з приладу або конкретних вимог до кожного флуоресцентного зонда.
3. Різні типи зразків містять різні типи та вміст інгібітора та кількість копій цільового гена.Обсяг зразка слід враховувати фактичним станом.Зробіть розведення зразка, додавши воду, що не містить нуклеази, або буфер TE, якщо необхідно.
4. Рекомендований обсяг різних проб:
| Зразок | Обсяг за один 50 мкл реакція | Максимум співвідношення |
| Антикоагулянт цільної крові | 2,5 мкл | 5% |
| плазма | 15 мкл | 30% |
| Сироватка | 10 мкл | 20% |
| Мазок з горла | 10 мкл | 20% |
| Слина | 10 мкл | 20% |
Контроль якості
1. Виявлення функцій: чутливість, специфічність і повторюваність КПЦР.
2. Відсутність екзогенної нуклеазної активності: відсутність екзогенної ендонуклеази та забруднення екзонуклеазою.
Примітки до продукту
1. У цьому продукті використовується новий тип ДНК-полімерази гарячого старту, яку можна активувати за 1-5 хвилин. Оскільки його реакційний буфер було оптимізовано, він більше підходить для кількісної ПЛР подвійної або множинної флуоресценції з використанням зондового методу.
2. Якщо значення Rn для ПЛР-ампліфікації занадто низьке або ампліфікація явно пригнічена, зменшення кількості зразка, збільшення об’єму реакції або попереднє розведення зразка можуть покращити результати.
3. Збір крові, слини, сечі, мазка з горла тощо має відповідати вимогам клінічних критеріїв, і свіжий зразок можна використовувати для запобігання деградації нуклеїнової кислоти.
4. Оскільки різні амплікони мають різну ефективність використання для dUTP і чутливість до UNG, реагенти слід оптимізувати, якщо чутливість виявлення знижується при використанні системи UNG.За потреби зв’яжіться з нами для отримання технічної підтримки.
5. Щоб уникнути ампліфікації залишкових продуктів ПЛР між одноетапними реакціями, для ампліфікації потрібні спеціальна експериментальна зона та піпетка.Працюйте в рукавичках і часто міняйте їх, а також не відкривайте реакційну пробірку після ПЛР-ампліфікації.
