Зворотна транскриптаза M-MLV
RevScript Зворотна транскриптаза отримана за допомогою технології генної інженерії.Має вищу здатність до синтезу кДНК, термостабільність і граничну температуру реакції (до 60°С).Синтезований продукт кДНК має розмір до 10 кб.Він підвищує спорідненість шаблонів і підходить для зворотної транскрипції шаблонів РНК зі складною вторинною структурою або генами з низьким рівнем копіювання.
компоненти
| компонент | HC2003B (10 000U) | HC2003B (5*10 000U) | HC2003B (200 000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/мкл) | 50 мкл | 5×50 мкл | 1 мл |
| 5 × буфер RevScript | 250 мкл | 1,25 мл | 5 мл |
Умови зберігання
Цей продукт слід зберігати при температурі -25°C~-15°C протягом 2 років.
Визначення одиниці
Одна одиниця включає 1 нмоль dTTP у нерозчинний у кислоті матеріал за 10 хвилин при 37°C з використанням Oligo(dT) як праймерів.
Налаштування реакції
1.Денатурація матриці РНК (цей крок необов’язковий, денатурація матриці РНК допомагає відкрити вторинні структури, що покращить вихід першого ланцюга кДНК.)
| компоненти | Обсяг (мкл) |
| ddH, вільний від РНКази2O | До 13 |
| Оліго(dT)18 (50 мкмоль/л) або випадковий праймер (50 мкмоль/л) Або геноспецифічні праймери (2 мкмоль/л) | 1 |
| або 1 | |
| або 1 | |
| шаблон РНК | X a |
Примітки:
1) a: Загальна РНК: 1-5 мкг або мРНК: 1-500 нг
2) Інкубація при 65°C протягом 5 хвилин, потім негайно перенесення на лід для охолодження протягом 2 хвилин.Коротке центрифугування, щоб зібрати реакційну рідину, додайте розчин реакції зворотної транскрипції, як показано в наступній таблиці.Обережно піпеткою перемішайте.
1.Приготування реакційної суміші (об’єм 20 мкл)
| компоненти | Обсяг (мкл) |
| Суміш попереднього етапу | 13 |
| 5×Буфер | 4 |
| Суміш dNTP (10 нмоль/л) | 1 |
| Зворотна транскриптаза (200 ОД/мкл) | 1 |
| Інгібітор РНКази (40 ОД/мкл) | 1 |
1.Проведіть реакцію за таких умов:
| Температура (°C) | час |
| 25 °Ca | 5 хв |
| 42 °Cb | 15-30 хв |
| 85 °Cc | 5 хв |
Примітки:
1) а.Інкубація при 25°C протягом 5 хвилин потрібна лише для використання випадкових гексамерів.Будь ласка, пропустіть цей крок, якщо використовуєте Oligo (dT)18або Gene Specific Primer.
2) б.Рекомендована температура зворотної транскрипції становить 42°C. Для шаблонів зі складною вторинною структурою або високим вмістом GC рекомендується підвищити температуру реакції до 50-55°C.
3) c.Нагрівання при 85°C протягом 5 хвилин для інактивації зворотної транскриптази.
4) Продукт можна безпосередньо використовувати в реакціях ПЛР або кПЦР або зберігати при -20°C для короткочасного зберігання.Рекомендується вирівнювати продукцію і зберігати при -80°C для тривалого зберігання.Уникайте частого заморожування-розморожування.
5) Продукт підходить для одноетапної RT-qPCR, рекомендується додавати 10-20 ОД зворотної транскриптази на кожні 25 мкл реакційної системи або поступово збільшувати кількість зворотної транскриптази відповідно до фактичної ситуації.
Примітки
1.Будь ласка, тримайте експериментальну зону в чистоті;Під час роботи необхідно надягати чисті рукавички та маску.Усі витратні матеріали, які використовуються в експерименті, не повинні містити РНКази, щоб запобігти забрудненню РНКазами.
2.Усі процедури слід проводити на льоду, щоб запобігти деградації РНК.
3.Для забезпечення високої ефективності зворотної транскрипції рекомендуються високоякісні зразки РНК.
4.Цей продукт призначений лише для дослідницького використання.
5.Для вашої безпеки працюйте в лабораторних халатах і одноразових рукавичках.
