ДНК-полімераза Hotstart Taq
ДНК-полімераза Taq з гарячим стартом (модифікація антитіла) — це термостабільна ДНК-полімераза з гарячим стартом із Thermus aquaticus YT-1, яка має полімеразну активність 5′→3′ і ендонуклеазну активність 5´ клаптя.ДНК-полімераза Taq гарячого старту — це ДНК-полімераза Taq, модифікована термолабільними антитілами Taq.Модифікація антитіла підвищила специфічність, чутливість і продуктивність ПЛР.
компоненти
| компонент | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq буфер | 4×1 мл | 4×10 мл | 4×50 мл | 5×400 мл |
| ДНК-полімераза гарячого старту Taq (модифікована антитілом) (5 ОД/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 5 мл | 10×5 мл |
Додатки
10 мМ Tris-HCl (pH 7,4 при 25 ℃), 100 мМ KCl, 0,1 мМ EDTA, 1 мМ дитіотреїтолу, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 і 50% гліцерину.
Умови зберігання
Транспортувати при температурі до 0°C і зберігати при -25°C~-15°C.
Визначення одиниці
Одна одиниця визначається як кількість ферменту, який включає 15 нмоль dNTP у нерозчинний у кислоті матеріал за 30 хвилин при 75°C.
Контроль якості
1.EndАктивність onuclease:Інкубація 20 ОД ферменту з 4 мкг pUC19 ДНК протягом 4 годин при 37 ℃ не призвела до виявленої деградації ДНК, як це було визначено електрофорезом у гелі.
2.5 кб Лямбда ПЛР:25 циклів ПЛР-ампліфікації 5 нг лямбда-ДНК з 1,25 одиницями ДНК-полімерази Taq у присутності 200 мкМ dNTP і 0,2 мкМ праймерів призводять до очікуваного продукту 5 кб.
3.Активність екзонуклеази:Інкубація 50 мкл реакційної суміші, що містить щонайменше 12,5 ОД Taq ДНК-полімерази, з 10 нмоль 5´-FAM олігонуклеотиду протягом 30 хвилин при 37 ℃ не призводить до виявленої деградації.
4.Активність РНКази:Інкубація 10 мкл реакції, що містить 20 ОД ферменту з 1 мкг транскриптів РНК протягом 2 годин при 37°C, не призвела до виявлення деградації РНК, як це було визначено електрофорезом у гелі.
5.Теплова інактивація:Немає.
Система реагування
| компоненти | Обсяг |
| Шаблон ДНКa | необов'язковий |
| 10 мкМ Forward Primer | 0,5 мкл |
| 10 мкМ зворотний праймер | 0,5 мкл |
| Суміш dNTP (10 мМ кожен) | 0,5 мкл |
| 5×HC Taq буфер | 5 мкл |
| Taq ДНК-полімеразаb(5U/мкл) | 0,125 мкл |
| Вода без нуклеаз | До 25 мкл |
Примітки:
1) а.
| ДНК | Сума |
| Геномний | 1 нг-1 мкг |
| Плазміда або вірус | 1 пг-1 нг |
2) б.Оптимальна концентрація ДНК-полімерази Taq може коливатися від 5-50 одиниць/мл (0,1-0,5 одиниць/25 мкл реакції) у спеціалізованих застосуваннях.
Термоциклічний протокол
ПЛР
| Крок | Температура(°C) | час | Цикли |
| Початкова денатураціяa | 95 ℃ | 1-3 хв | - |
| Денатурація | 95 ℃ | 15-30 с | 30-35 циклів |
| Відпалb | 45-68 ℃ | 15-60 с | |
| Розширення | 68 ℃ | 1 Кб/хв | |
| Остаточне розширення | 68 ℃ | 5 хв | - |
Примітки:
1) Початкова денатурація тривалістю 1 хв при 95°C є достатньою для більшості ампліфікацій.Для складних шаблонів рекомендується довша денатурація 2-3 хвилини при 95°C.За допомогою ПЛР колоній рекомендується початкова денатурація протягом 5 хвилин при 95°C.
2) Етап відпалу зазвичай становить 15-60 с.Температура відпалу залежить від Tm пари праймерів і зазвичай становить 45-68 ℃.
