Набір для прямої ПЛР рослин

Каталожний номер: HCR2020A

Набір Plant Direct PCR Kit підходить для прямої ампліфікації листя рослин, насіння тощо та може використовуватися для високопродуктивного скринінгу зразків рослин, які не містять полісахаридів і поліфенолів.ДНК-полімераза прямої ампліфікації, заснована на спрямованій еволюції, має чудову толерантність до інгібіторів ПЛР у рослинах.Водночас він підтримує високу ефективність ампліфікації, яка підходить для ампліфікації фрагментів ДНК у межах 5 кб.Унікальний буфер для лізису А в наборі можна використовувати для лізису свіжих або заморожених рослинних тканин.Ним легко керувати, і лізат можна використовувати як матрицю для ампліфікації без очищення.Система містить захисні речовини, які дозволяють ефективно ампліфікувати сирі зразки після багаторазового заморожування та розморожування.2 × Plant Direct Master Mix потребує лише додавання праймерів і шаблонів для проведення реакції ампліфікації, що зменшує кількість операцій піпетування та покращує продуктивність виявлення та відтворюваність результатів.

компоненти

*Буфер прямого лізису рослин В є додатковим реагентом, який використовується для нейтралізації буфера прямого лізису рослин А для продовження часу зберігання зразків.Його можна використовувати відповідно до реальної ситуації.

Умови зберігання

2 × Plant Direct Master Mix, зберігати при -30 ~ -15 ℃ і уникати повторного заморожування та розморожування;Буфер прямого лізису рослин, зберігати при -30 ~ -15 ℃ або 2 ~ 8 ℃.

Процес експерименту

Обробка зразків–Лист рослини

Прямий метод:Рекомендується використовувати молоде листя.Використовуйте дирокол із фіксованим діаметром 0,5–3 мм, щоб отримати невеликий однорідний зразок, а потім безпосередньо додайте зразок до системи ПЛР (рекомендовано систему 50 мкл).Зверніть увагу: переконайтеся, що зразок знаходиться в розчині для ПЛР, а не на стінці пробірки.Якщо пряма ПЛР використовується для ампліфікації довгих фрагментів і складних зразків, використання зразка меншого діаметру (0,5 – 1 мм) як матриці може допомогти отримати кращі результати.

Метод лізису подрібнення:Рекомендується використовувати молоде листя.Візьміть невеликий шматочок листя (приблизно 1-3 мм в діаметрі), помістіть його в 20 мкл буфера для прямого лізису рослин Ab і подрібніть його якомога сильніше (цей крок можна зробити, стиснувши лист наконечником піпетки на 100 мкл). розім’яти зразок).Якщо використовуються більші об’єми тканини листя (не перевищують 7 мм), збільште об’єм буфера для розведення до 50 мкл.Після подрібнення листя розчин повинен мати зелений колір.Після короткого центрифугування додайте 1 мкл супернатанту в систему ПЛР як реакційну матрицюc.

Метод термічного лізису:Рекомендується використовувати молоде листя.Візьміть невеликий шматочок листя (приблизно 1-3 мм в діаметрі), помістіть його в 20 мкл буфера для прямого лізису рослин A і нагрійте його при 95 °C протягом 5-10 хвилин.Час лізису можна відповідно збільшити для листя, яке важко лізувати (не більше 20 хв).Якщо використовуються більші об’єми тканини листя (не перевищують 7 мм), збільште об’єм буфера для розведення до 50 мкл.Після нагрівання коротко відцентрифугуйте та додайте 1 мкл супернатанту в систему ПЛР як реакційну матрицюb.

Обробка зразків– Насіння рослин

Метод лізису подрібнення:За допомогою скальпеля виріжте насіння діаметром 5 мм, додайте їх до 100 мкл буфера для прямого лізису рослин А та подрібніть зразок наконечником піпетки або іншим інструментом.Коротко перемішайте і дайте постояти при кімнатній температурі 3–5 хв.Переконайтеся, що зразок насіння занурений у буфер для розведення.Після короткого центрифугування додайте 1 мкл супернатанту в систему ПЛР як реакційну матрицю.

Метод термічного лізису:Використовуйте скальпель, щоб вирізати насіння діаметром 5 мм, додати їх до 100 мкл буфера для прямого лізису рослин А та нагріти при 95 °C протягом 5-10 хв.Час лізису можна відповідно збільшити для листя, яке важко лізувати (не більше 30 хв).Після нагрівання коротко відцентрифугуйте та додайте 1 мкл супернатанту до системи ПЛР як реакційну матрицюb.

a.Ножиці або інші інструменти також можна використовувати для вирізання зразків відповідного розміру;якщо перфоратор або ножиці використовуються повторно, їх слід очистити 2% розчином гіпохлориту натрію перед кожним використанням, щоб запобігти перехресному забрудненню між зразками.

b.Перед використанням переконайтеся, що буфер прямого лізису рослин повністю розплавлений.Якщо буфер в’язкий або має осад, його можна нагріти до 37 ℃, щоб повністю розплавити перед використанням.

в.Об’єм матриці в реакційній системі можна відповідним чином регулювати відповідно до різниці в об’ємі рослинного матеріалу та доданого розчинника.

Буфер прямого лізису рослин

Буфер прямого лізису рослин A, що міститься в цьому продукті, був строго оптимізований для вивільнення геному більшості рослинних тканин і підходить для короткочасного зберігання сирих рослин при 4 ℃.Якщо зразок потрібно зберігати протягом більш тривалого періоду часу (наприклад, 1-2 місяці), рекомендується перенести супернатант в нову пробірку EP і зберігати його при -20 ℃.Щоб зберігати зразки більш стабільно, додайте рівний об’єм буфера прямого лізису рослин B до перенесеної супернатанту, добре перемішайте та зберігайте при -20 ℃.Стабільний час зберігання залежить від зразків рослин і станів.

Система реагування

a.Він містить Mg²⁺в кінцевій концентрації 2 мМ.

b.Рекомендується використовувати кінцеву концентрацію 0,4 мкМ для кожного праймера.Надмірне використання праймерів призведе до збільшення неспецифічної ампліфікації.

в.Кількість використаного зразка можна регулювати відповідно до фактичної ситуації.Кількість, що використовується в одній реакції неочищеного лізованого зразка, можна регулювати в межах 2% – 20% від загального об’єму реакції.Використання занадто великої кількості зразків може призвести до збою ампліфікації.

Програма реагування

a.Початкова денатурація (98 ℃, 5 хв) сприяє лізису рослинної тканини, вивільняючи геномну ДНК, яку можна використовувати для ПЛР-ампліфікації.Не скорочуйте час і не знижуйте температуру.

b.Рекомендується встановити його рівним значенню Tm праймера або на 2 ~ 4 ℃ вище значення Tm.ДНК-полімераза прямої ампліфікації, яка використовується в цьому продукті, відрізняється від звичайної ДНК-полімерази Taq і має особливі вимоги до температури реакції відпалу; використання високої температури відпалу може ефективно зменшити неспецифічну ампліфікацію та підвищити ефективність ампліфікації.Для складних шаблонів ефективного посилення можна досягти шляхом регулювання температури відпалу та подовження часу розширення.

в.Якщо довжина продукту ампліфікації становить ≤1 кб, час подовження встановлюється на рівні 30 с/кб;якщо довжина продукту ампліфікації >1 кб, час подовження встановлюється на рівні 60 с/кб.

d.Для складних зразків або зразків із низьким виходом ампліфікації кількість циклів можна відповідно збільшити до 40–50 циклів.

Додатки

Він застосовний для прямої ампліфікації рослинних тканин і високопродуктивного скринінгу зразків рослин, які не містять полісахаридів і поліфенолів.

Примітки

Тільки для дослідницького використання.Не для використання в діагностичних процедурах.

1. Для сирої ампліфікації рослин або прямої ампліфікації рекомендується використовувати очищену геномну ДНК як позитивний контроль перед початком експерименту, щоб переконатися, що система, праймери та операції правильні.

2. ДНК-полімераза прямої ампліфікації, яка використовується в цьому наборі, має сильну коректурну активність.Якщо необхідно виконати клонування ТА, рекомендується очистити ДНК перед додаванням аденіну.

3. Інструкції з розробки грунтовки:

a.Рекомендується, щоб остання основа на 3' кінці праймера була G або C.

b.Слід уникати послідовних невідповідностей в останніх 8 основах на 3' кінці праймера.в.Уникайте шпилькових структур на 3' кінці грунтовки.

d.Різниця в значенні Tm прямого праймера та зворотного праймера не повинна перевищувати 1 ℃, а значення Tm слід відкоригувати до 60 ~ 72 ℃ (рекомендується Primer Premier 5 для розрахунку значення Tm).

д.Додаткові додаткові послідовності праймерів, які не збігаються з шаблоном, не слід включати під час розрахунку значення Tm праймера.

f.Рекомендується, щоб вміст GC грунтовки становив 40% -60%.

g.Загальний розподіл A, G, C і T у грунтовці має бути максимально рівномірним.Уникайте використання регіонів з високим вмістом GC або AT.

ч.Уникайте присутності комплементарних послідовностей з 5 або більше основ всередині праймера або між двома праймерами та уникайте присутності комплементарних послідовностей з 3 або більше основ на 3'-кінці двох праймерів.

i.Використовуйте функцію NCBI BLAST, щоб перевірити специфічність праймера, щоб запобігти неспецифічній ампліфікації.