Інгібітор Рнази
Інгібітор мишачої РНКази - це рекомбінантний інгібітор мишачої РНКази, експресований та очищений з E.coli.Він зв’язується з РНКазою A, B або C у співвідношенні 1:1 за допомогою нековалентного зв’язку, тим самим пригнічуючи активність трьох ферментів і захищаючи РНК від деградації.Однак він не ефективний проти РНКази 1, РНКази T1, нуклеази S1, РНКази H або РНКази Aspergillus.Інгібітор мишачої РНКази був протестований за допомогою RT-PCR, RT-qPCR та IVT мРНК і був сумісний з різними комерційними зворотними транскриптазами, ДНК-полімеразами та РНК-полімеразами.
У порівнянні з інгібіторами людської РНКази інгібітор мишачої РНКази не містить двох цистеїнів, які є дуже чутливими до окислення, що спричиняє інактивацію інгібітора.Це робить його стабільним при низьких концентраціях DTT (менше 1 мМ).Ця особливість робить його придатним для використання в реакціях, де високі концентрації DTT є несприятливими для реакції (наприклад, RT-PCR у реальному часі).
Aдодаток
Цей продукт можна широко використовувати в будь-якому експерименті, де можливе втручання РНКази, щоб уникнути деградації РНК, наприклад:
1.Синтез першого ланцюга кДНК, RT-PCR, RT-qPCR та ін.
2.Захищає РНК від деградації під час транскрипції/трансляції in vitro (наприклад, система реплікації вірусу in vitro).
3.Пригнічення активності РНКази під час виділення та очищення РНК.
Умови зберігання
Продукт можна зберігати при -25～- 15 ℃, придатний протягом 2 років.
Буфер зберігання
50 мМ KCl, 20 мМ HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 мМ DTT і 50% гліцерину.
Визначення одиниці
Кількість інгібітора мишачої РНКази, необхідної для інгібування активності 5 нг рибонуклеази А на 50%, визначали як одну одиницю (U).
Молекулярна маса білка
Молекулярна маса інгібітора мишачої РНКази становить 50 кДа.
Контроль якості
Екзонуклеаза діяльність:
40 ОД інгібітора мишачої РНКази з 1 мкг λ-Hind III розщепленої ДНК при 37 ℃ протягом 16 годин не призводить до розкладання, як визначено за допомогою електрофорезу в агарозному гелі.
Ендонуклеазна активність:
40 ОД інгібітора мишачої РНКази з 1 мкг λ ДНК при 37 ℃ протягом 16 годин не призводить до розкладання, як визначено електрофорезом у агарозному гелі.
Надрізання діяльність:
40 ОД інгібітора мишачої РНКази з 1 мкг pBR322 при 37 ℃ протягом 16 годин не призводить до розкладання, як визначено електрофорезом у агарозному гелі.
РНКаза діяльність:
40 ОД інгібітора мишачої РНКази з 1,6 мкг MS2 РНК протягом 4 годин при 37 ℃ не призводить до розкладання, як визначено електрофорезом у агарозному гелі.
E.coli ДНК:
40 ОД інгібітора мишачої РНКази перевіряють на наявність геномної ДНК E. coli за допомогою кПЦР TaqMan з праймерами, специфічними для локусу 16S рРНК E. coli.Контамінація геномної ДНК E. coli становить ≤ 0,1 пг/40 од.
Nприміткаs
1. Сильне коливання або перемішування призведе до інактивації ферменту.
2. Оптимальний температурний діапазон цього інгібітора був 25-55 ℃, і він був інактивований при 65 ℃ і вище.
3. Активність РНКази H, РНКази 1 і РНКази T1 не інгібувалася інгібітором мишачої РНКази.
4. Інгібування активності РНКази було виявлено в широкому діапазоні рН (рН 5-9 усі були активними), а найвища активність спостерігалася при рН 7-8.
5. Оскільки рибонуклеази зазвичай зберігають активність в умовах денатурації, необхідно бути обережним, щоб уникнути денатурації молекул інгібіторів РНКази, які утворили комплекс з рибонуклеазою.Щоб запобігти вивільненню активної рибонуклеази, слід уникати температур вище 50 °C і високих концентрацій сечовини або інших денатуруючих агентів.
