Міні-набір для екстракції ДНК
У цьому наборі використовується оптимізована буферна система та технологія очищення колонки з силікагелем, яка може відновлювати фрагменти ДНК розміром 70 bp – 20 kb з різних концентрацій TAE або TBE агарозного гелю.ДНК-адсорбційна колонка може спеціально адсорбувати ДНК в умовах високого вмісту солі.Крім того, набір може безпосередньо очищати фрагменти ДНК від продуктів ПЛР, систем ферментативних реакцій або неочищених продуктів ДНК, отриманих іншими методами, і видаляти домішки, такі як білки, інші органічні сполуки, іони неорганічної солі та олігонуклеотидні праймери.Це може гарантувати, що очищення може бути завершено протягом 10-15 хв.Очищену ДНК можна використовувати безпосередньо для лігування, трансформації, розщеплення ферментами, транскрипції in vitro, ПЛР, секвенування, мікроін’єкцій тощо.
Умови зберігання
Зберігати при -15 ~ -25 ℃ і транспортувати при кімнатній температурі.
компоненти
| компоненти | (100 rxns) |
| Буферний ВВП | 80 мл |
| Буфер GW | 2 × 20 мл |
| Буфер для елюції | 20 мл |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Буферний ВВП:буфер зв'язування ДНК.
Буфер GW:Промивний буфер;перед використанням додайте абсолютний етанол до об’єму, зазначеного на пляшці.
Буфер для елюції:Елюювання.
FastPure DNA Mini Columns-G:ДНК-адсорбційні колонки.
Пробірки для збору 2 мл:Пробірки для збору фільтрату.
Підготовлені матеріали
1,5 мл стерилізованих пробірок, абсолютний етанол та ізопропанол (якщо фрагмент ДНК ≤100 bp, додайте 1 об’єм
ізопропанолу на 1 об’єм гелю), водяна баня.
Процес експерименту
Додайте 80 мл етанолу до розведення буфера GW, як зазначено на етикетці перед використанням, зберігайте при кімнатній температурі.
Механізм
1. Реакційний розчин ПЛР
Схема гелевої екстракції: Додати рівний об’єм буфера GDP ПЛР Реакційний розчин Схема відновлення:Додайте 5-кратний об’єм буфера
2. ВВП Обчислити об'єм гелю(100 μl дорівнює 100 мг)
Розчинити гель
3. Розігріти при 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Додайте 300 мкл буфера GDP*
Додайте 700 мкл буфера GW
Додайте 700 мкл буфера GW
5. Елююють
Додайте 20–30 мкл буфера для елюції або деіонізованої води
Примітки* Відновлення реакційної рідини ПЛР без цього етапу
Програму для екстракції гелю
1. Після електрофорезу ДНК для фракціонування фрагментів ДНК виріжте одну смужку фрагмента ДНК з агарозного гелю під УФ-світлом.Рекомендується використовувати абсорбуючий папір для поглинання видимої вологи гелю та мінімізації розміру зрізу гелю шляхом видалення зайвої агарози, наскільки це можливо.Зважте зріз гелю (без мікроцентрифужної пробірки), щоб обчислити його об’єм: об’єм 100 мг зрізу гелю становить приблизно 100 мкл, припускаючи, що щільність становить 1 г/мл.
2. Додайте рівний об’єм буфера GDP, інкубуйте при 50~55 ℃ протягом 7-10 хвилин (відповідно до розміру гелю, відрегулюйте час інкубації, поки гель повністю не розчиниться).Переверніть пробірку 2 рази під час інкубації.
Δ Додавання 1-3 об’ємів буфера GDP не вплине на ефективність відновлення ДНК.Якщо фрагмент ДНК, який потрібно відновити, <100 bp, необхідно додати 3 об’єми буфера GDP;коли шматочок гелю повністю розчиниться, додайте 1 об’єм ізопропанолу та ретельно перемішайте, а потім перейдіть до наступного кроку.
3. Коротко відцентрифугуйте, щоб довести зразок до дна пробірки, вставте FastPure DNA Mini Columns-G у пробірки для збору 2 мл, обережно перенесіть розчин максимум 700 мкл один раз на
час до фільтраційних колонок, центрифуга при 12 000 об/хв (13 800 X g) протягом 30-60 сек.
4. Відкиньте фільтрат і додайте 300 мкл буфера GDP до колонки, інкубуйте при кімнатній температурі протягом 1 хвилини, центрифугуйте при 12 000 об/хв (13 800 X g) протягом 30-60 секунд.
5. Викиньте фільтрат і додайте 700 мкл буфера GW (перевірте, чи був доданий абсолютний етанол заздалегідь!) у колонку, центрифугуйте при 12 000 об/хв (13 800 X g) протягом 30-60 секунд.
Δ Додайте буфер GW навколо стінки адсорбційної колонки або додайте задню кришку буфера GW і перемішайте його догори дном 2–3 рази, щоб повністю змити сіль, що прилипла до стінки трубки.
6. Повторіть крок 5.
Δ Промивання буфером GW двічі може забезпечити повне видалення солі та усунути вплив на наступні експерименти.
7. Викиньте фільтрат і центрифугуйте порожню колонку при 12 000 об/хв (13 800 X g) протягом 2 хв.
8. Вставте колонку в чисту мікроцентрифужну пробірку на 1,5 мл, додайте 20–30 мкл буфера для елюції в центр мембрани колонки, інкубуйте 2 хвилини, а потім центрифугуйте при 12 000 об/хв (13 800 X g) протягом 1 хвилини.Викиньте колонку, зберігайте отриману ДНК при -20 .
Δ Перенесення супернатанту етапу 8 у колонку для повторного елюювання та попереднє нагрівання буфера для елюції до 55 (коли фрагмент ДНК >3 кб) може допомогти підвищити ефективність відновлення.
Програма відновлення продуктів ПЛР
Цей протокол застосовний для очищення фрагментів ДНК від продуктів ПЛР, системи ферментативних реакцій та інших неочищених продуктів ДНК (включаючи генетичну ДНК).Цей розчин може ефективно видаляти різні нуклеотиди, праймери, димери праймерів, молекули солі, ферменти та інші домішки.
1. Коротко відцентрифугуйте продукти ПЛР, розчин ферментативної реакції та інші неочищені продукти ДНК.Оцініть їх об’єм піпеткою та перенесіть у стерилізовану пробірку на 1,5 або 2 мл.Додати ddH2O до об’єму 100 мкл;тоді як для геномної ДНК з високою концентрацією розбавлення до 300 мкл ddH2O допоможе підвищити ефективність відновлення.
2. Додайте 5 об’ємів буфера GDP, ретельно перемішайте, перевертаючи або вортексуючи.Якщо цікавий фрагмент ДНК >100 bp, необхідно додати додаткові 1,5 об’єму (зразки + буфер GDP) етанолу.
3. Вставте колонку назад у пробірку для збору, перенесіть суміш у колонку, центрифугуйте при 12 000 об/хв (13 800 × g) протягом 30–60 секунд.Якщо об’єм змішаного розчину >700 мкл, помістіть адсорбційну колонку назад у збірну пробірку, перенесіть решту розчину в адсорбційну колонку та центрифугуйте при 12 000 об/хв (13 800 × g) протягом 30–60 секунд.
4. Наступне виконання відноситься до кроків 5 – 8 програми 08-1/Гель-екстракція.
Додатки
Різні концентрації TAE або TBE агарозного гелю;Продукти ПЛР, системи ферментативних реакцій або інші неочищені продукти ДНК, отримані різними методами.Відновлені фрагменти варіювалися від70 bp -20 kb.
Примітки
Тільки для дослідницького використання.Не для використання в діагностичних процедурах.
1. Додайте 80 мл етанолу до розведення буфера GW, як зазначено на етикетці перед використанням, зберігайте при кімнатній температурі.
2. Якщо буфер GDP легко випадає в осад під час зберігання при низькій температурі, перед використанням його можна помістити при кімнатній температурі на деякий час.При необхідності його можна попередньо нагріти на водяній бані при 37 ℃ до повного розчинення осаду, а потім використовувати після змішування.
3. Попередньо встановіть температуру водяної бані на 50 ~ 55 ℃.
4. У програмі 08-1/Екстракція гелю, крок 1, мінімізація розміру зрізу гелю значно скоротить час розчинення та підвищить ефективність відновлення (лінеаризована ДНК легко гідролізується під час постійного впливу високої температури).Не піддавайте гель ДНК дії ультрафіолету протягом тривалого часу, оскільки ультрафіолет може спричинити пошкодження ДНК.
5. Повністю розчиніть гель у 08-1/Програма екстракції гелю, крок 2, інакше ефективність відновлення ДНК буде серйозно вплинута.
6. Попередньо нагрійте буфер для елюції або ddH2O до 55 ℃, що допоможе підвищити ефективність елюції ДНК.Рекомендується зберігати ДНК в елюенті 2,5 мМ Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
