Урацил ДНК-глікозилаза
Урацил-ДНК-глікозилаза (УНГ або УДГ) є рекомбінантним клоном E.coli з молекулярною масою 25 кДа.Він каталізує вивільнення вільного урацилу з одноланцюгової та дволанцюгової ДНК, що містить урацил, неактивний щодо РНК і може використовуватися для запобігання забрудненню продуктів ампліфікації ПЛР.Принцип дії заснований на тому факті, що якщо в реакції ПЛР замінити dTTP на dUTP і утворити продукт ампліфікації ПЛР, що містить основи dU, фермент може вибірково розривати глікозидний зв’язок основ U в одноланцюгових і дволанцюгових. ДНК і розкладають продукт ПЛР-ампліфікації.
Рекомендоване застосування
Запобігання забрудненню Посилення
Умови зберігання
-20°C для тривалого зберігання, слід добре перемішати перед використанням, уникати частого заморожування-розморожування.
Буфер зберігання
20 мМ трис-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, стабілізатор, 50% гліцерин.
Визначення одиниці
Кількість ферменту, необхідного для розкладання 1 мкг одноланцюгової ДНК, що містить основи dU, за 1 годину при 37°C становить 1 одиницю.
Контроль якості
1.Електрофоретична чистота SDS-PAGE більше 98%
2.Чутливість посилення, контроль від партії до партії, стабільність
3.Після того, як 1 UNG обробляється при 50 ℃ протягом 2 хвилин, шаблон, що містить U менше 103 копій, повинен бути повністю деградований, і продукт ампліфікації не може бути отриманий
4.Відсутність екзогенної нуклеазної активності
Інструкції
| компоненти | Об'єм (мкл) | Кінцева концентрація |
| 10 × ПЛР-буфер (без dNTP, Mg²+безкоштовно) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 мкМ |
| dUTP (замінити dTTP) | - | 200-600 мкМ |
| 25 мМ MgCl2 | 2-8 мкл | 1-4 мМ |
| 5 Од/мкл Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 Од/мкл UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × грунтувальна сумішa | 2 | 1× |
| Шаблон | - | <1 мкг/реакцію |
| ddH₂O | До 50 | - |
Примітка: a: якщо використовується для ПЛР/кВТ-ПЛР, флуоресцентний зонд слід додати в реакційну систему.Зазвичай кінцева концентрація праймера 0,2 мкМ може дати хороші результати;коли продуктивність реакції погана, концентрацію праймера можна регулювати в діапазоні 0,2-1 мкМ.Зазвичай концентрація зонда оптимізована в діапазоні 0,1-0,3 мкМ.Можна провести експерименти з градієнтом концентрації, щоб знайти найкращу комбінацію праймера та зонда.
Примітки
1.Фермент UNG можна використовувати для видалення забруднених продуктів ампліфікації dUTP з реакційної системи перед реакцією ампліфікації ПЛР, щоб потім уникнути хибнопозитивних результатів через забруднення продукту.
2.Оптимальна температура для ферменту UNG, який використовується в реакції ПЛР проти забруднення, зазвичай становить 50 ℃ протягом 2 хвилин;умова інактивації становить 95 ℃ протягом 5 хвилин.
3.Уникайте частого заморожування-розморожування та не піддавайте значним коливанням температури.
4.Різні гени, які підлягають ампліфікації, мають різну ефективність використання dUTP і чутливість до ферменту UNG, тому, якщо використання системи UNG призводить до зниження чутливості виявлення, систему реакції слід налаштувати та оптимізувати, якщо вам потрібна технічна підтримка, будь ласка, зв’яжіться з Наша компанія.
