Superstart qPCR Premix plus-UNG
Каталожний номер: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG — це спеціалізований реагент, призначений для якісних і кількісних реакцій ПЛР у реальному часі з використанням детекції на основі зонда, розроблений спеціально для процесів ліофілізації.Він містить новий ензим гарячого старту Hotstart Taq plus (DG), активність якого ензиму Taq закрита при кімнатній температурі, ефективно пригнічуючи неспецифічну ампліфікацію, спричинену неспецифічним відпалом праймера або утворенням димеру праймера за умов низької температури, таким чином покращуючи специфічність реакції посилення.У цьому реагенті використовується оптимізований специфічний буфер qPCR і система захисту від забруднень UNG/dUTP для досягнення швидкого гарячого старту, значно покращуючи ефективність і чутливість реакцій qPCR.Він може отримати хороші стандартні криві в широкому діапазоні областей кількісного визначення та точно виконувати кількісне визначення, ефективно запобігаючи хибнопозитивній ампліфікації, викликаній залишковими продуктами ПЛР або аерозольним забрудненням.Цей реагент сумісний з більшістю флуоресцентних інструментів для кількісної ПЛР від таких виробників, як Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad і Roche тощо, і демонструє добру стабільність у ліофілізованій формі.
Склад реагентів
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+безкоштовно) (DG)
2. 250 мМ MgCl2
3. 4×ліопротектор (опціонально)
Умови зберігання
Тривале зберігання при -20℃;можна зберігати при 4 ℃ до 3 місяців.Добре перемішайте перед використанням іуникайте повторного заморожування та розморожування.
Велосипедний протокол
| Процедура | темп. | час | Цикл |
| Травлення | 50 ℃ | 2 хв | 1 |
| Активація полімерази | 95 ℃ | 1~5 хв | 1 |
| Денатурація | 95 ℃ | 10~20 с | 40-50 |
| Відпал і нарощування | 56~64 ℃ | 20~60 с | 40-50 |
qPCR Liquid Reaction SyПідготовка стебла
|
Композиція |
Об'єм 25 мкл |
Об'єм 50 мкл |
Остаточна концентрація |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+безкоштовно) (DG) | 5 мкл | 10 мкл | 1× |
| 250 мМ MgCl2 | 0,45 мкл | 0,9 мкл | 4,5 мМ |
| 4×ліопротектор1 | 6,25 мкл | 12,5 мкл | 1× |
| 25 × Суміш праймер-зонд2 | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| Шаблон ДНК3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | До 25 мкл | До 50 мкл | —— |
1. Кінцева концентрація 0,2 мкМ для праймерів зазвичай дає хороші результати;якщо реакція погана, за потреби відрегулюйте концентрацію праймера в діапазоні 0,2-1 мкМ.Концентрація зонда зазвичай оптимізується в діапазоні 0,1-0,3 мкМ за допомогою градієнтних експериментів, щоб знайти оптимальні комбінації.
2. Кількість копій цільових генів, що містяться в різних типах шаблонів, різна;якщо необхідно, можна виконати градієнтне розведення, щоб визначити оптимальну кількість додавання шаблону.
3. Ця система може бути ліофілізована;коли клієнти використовують цю систему без вимог до сушіння заморожуванням, можна вибірково додавати ліопротектор 4 ×; якщо потрібні ліофілізовані продукти, під час перевірки ефективності продукту на стадії рідких реагентів необхідно додати ліопротектор 4 × для забезпечення узгодженості з компонентами ліофілізованої системи і ефекти.
Коли система використовуєтьсяd для сублімаційного сушіння підготуйте система as наступне:
| Композиція | 25мкл Система реагування |
| 5 × HotstartPremix plus-UNG (Mg2+безкоштовно) (DG) | 5 мкл |
| 250 мМ MgCl2 | 0,45 мкл |
| 4×ліопротектор | 6,25 мкл |
| 25 × суміш праймер-зонд | 1 мкл |
| ddH2O | До 18~20 мкл |
* Якщо потрібні інші системи для сублімаційного сушіння, проконсультуйтеся окремо.
Процедура ліофілізаціїss
| Процедура | темп. | час | Хвороба | Тиск |
| Попереднє заморожування | 4 ℃ | 30 хв | Тримайте |
1 атм |
| -50 ℃ | 60 хв | Охолодження | ||
| -50 ℃ | 180 хв | Тримайте | ||
| Первинна сушка | -30℃ | 60 хв | Опалення |
Абсолютний вакуум |
| -30℃ | 70 хв | Тримайте | ||
| Вторинна сушка | 25℃ | 60 хв | Опалення |
Абсолютний вакуум |
| 25℃ | 300 хв | Тримайте |
2. Наведений вище процес ліофілізації лише для довідки.Різні типи продукції та різні сублімаційні сушарки мають різні параметри, тому коригування можна вносити відповідно до фактичнихумови під час використання.
3. Різні процеси ліофілізації можуть підходити для різних розмірів партій ліофілізованогопродуктів, тому при використанні для великомасштабного виробництва необхідно провести достатню валідацію тестування.
Інструкція по застосуванню ліофілізатуд порошок
1. Коротко відцентрифугуйте ліофілізований порошок;
2. Додайте шаблон нуклеїнової кислоти до ліофілізованого порошку та додайте воду до 25 мкл;
3. Добре перемішайте центрифугуванням і запустіть на машину.
Контроль якості:
1. Функціональне тестування: чутливість, специфічність, відтворюваність КПЦР.
2. Відсутність екзогенної нуклеазної активності, відсутність екзогенного забруднення ендо/екзонуклеазою.
Технічна інформація:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG використовує новий фермент гарячого старту, який забезпечує швидкий гарячий старт протягом 1~5 хвилин;завдяки спеціальному буферному складу він підходить для мультиплексних флуоресцентних кількісних реакцій ПЛР.
2. Він має більш високу специфічність, що значно покращує чутливість кількісного виявлення меж ПЛР флуоресценції, нормалізуючи криві ампліфікації, значення флуоресценції отримує очевидне покращення при низьких концентраціях шаблонів, підходить як реагенти для кількісного виявлення флуоресценції високої чутливості.
3. Для праймерів із нижчою температурою відпалу або фрагментів довжиною понад 200 bp рекомендується 3-етапний метод.
4. Ефективність використання dUTP і чутливість до ферменту UNG відрізняються для різних цільових генів, тому, якщо використання системи UNG призводить до зниження чутливості виявлення, реакційну систему слід скоригувати та оптимізувати.Якщо потрібна технічна підтримка, зверніться до нашої компанії.
5. Використовуйте спеціальні зони та піпетки до та після ампліфікації, одягайте рукавички під час роботи та часто замінюйте їх;не відкривайте реакційну пробірку після завершення ПЛР, щоб мінімізувати забруднення зразків продуктами ПЛР.
