Протеїназа K (рідка)
Каталожний номер: HC4502A
Протеїназа К є стабільною сериновою протеазою з широкою субстратною специфічністю.Він розкладає багато білків у нативному стані навіть у присутності миючих засобів.Дані досліджень кристалічної та молекулярної структури вказують на те, що фермент належить до сімейства субтилізину з каталітичною тріадою активного центру (Asp39-Його69- сер224).Переважним місцем розщеплення є пептидний зв'язок, що примикає до карбоксильної групи аліфатичних і ароматичних амінокислот із заблокованими альфа-аміногрупами.Він зазвичай використовується за широкийспецифіка.
Специфікація
| Зовнішній вигляд | Безбарвна або світло-коричнева рідина |
| діяльність | ≥800 Од/мл |
| Концентрація білка | ≥20 мг/мл |
| ДНКаза | Не виявлено |
| РНКаза | Не виявлено |
Умови зберігання
Зберігати при температурі 2-8 ℃.
Властивості
| номер EC | 3.4.21.64 (рекомбінант з Tritirachium album) |
| Молекулярна вага | 29 кДа (SDS-PAGE) |
| Ізоелектрична точка | 7.81 |
| Оптимальний pH | 7,0-12,0 Рис.1 |
| Оптимальна температура | 65 ℃ Рис.2 |
| Стабільність pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 год) Рис.3 |
| Термостабільність | Нижче 50 ℃ (pH 8,0, 30 хвилин) Рис.4 |
| активатори | SDS, сечовина |
| інгібітори | диізопропілфторфосфат;фенілметилсульфонілфторид |
Додатки
1. Набір для генетичної діагностики
2. Набори для виділення РНК і ДНК
3. Екстракція небілкових компонентів із тканин, деградація білкових домішок, таких як ДНК-вакцини та приготування гепарину
4. Отримання хромосомної ДНК методом імпульсного електрофорезу
5. Вестерн-блот
6. Ферментативні глікозильовані альбумінові реагенти in vitro діагностика
Запобіжні заходи
Одягайте захисні рукавички та окуляри під час використання або зважування та добре провітрюйте після використання.Цей продукт може викликати шкірну алергічну реакцію та серйозне подразнення очей.При вдиханні це може викликати симптоми алергії або астми або задишку.Може викликати подразнення дихальних шляхів.
аналіз
Визначення одиниці
Одна одиниця (U) визначається як кількість ферменту, необхідного для гідролізу казеїну для отримання 1 мкмоль тирозину на хвилину за таких умов.
Приготування реактивів
Реагент I: 1 г молочного казеїну розчиняють у 50 мл 0,1 М розчину фосфату натрію (pH 8,0), інкубують у воді при 65-70 ℃ протягом 15 хвилин, перемішують і розчиняють, охолоджують водою, доводять pH 8,0 за допомогою гідроксиду натрію та фіксують об'єм 100 мл.
Реагент II: розчин TCA: 0,1 М трихлороцтової кислоти, 0,2 М ацетату натрію, 0,3 М оцтової кислоти.
Реагент III: 0,4 М Na2CO3рішення.
Реактив IV: реактив форинта, розбавлений чистою водою в 5 разів.
Реагент V: ферментний розчинник: 0,1 М розчин фосфату натрію (pH 8,0).
Реагент VI: Розчин тирозину: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 мкмоль/мл тирозину, розчиненого в 0,2 М HCl.
Процедура
1. 0,5 мл реагенту I попередньо нагрівають до 37 ℃, додають 0,5 мл розчину ферменту, добре перемішують та інкубують при 37 ℃ протягом 10 хвилин.
2. Додайте 1 мл реагенту II, щоб зупинити реакцію, добре перемішайте та продовжуйте інкубацію протягом 30 хвилин.
3. Центрифугувати реакційний розчин.
4. Візьміть 0,5 мл супернатанту, додайте 2,5 мл реагенту III, 0,5 мл реагенту IV, добре перемішайте та інкубуйте при 37 ℃ протягом 30 хвилин.
5. ОД660визначався як OD1;порожня контрольна група: 0,5 мл реагенту V використовують для заміни розчину ферменту для визначення OD660як OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Стандартна крива L-тирозину: 0,5 мл розчину L-тирозину різної концентрації, 2,5 мл реагенту III, 0,5 мл реагенту IV у центрифужній пробірці на 5 мл, інкубувати при 37 ℃ протягом 30 хвилин, визначити OD660для різних концентрацій L-тирозину, потім отримано стандартну криву Y=kX+b, де Y — концентрація L-тирозину, X — OD600.
Розрахунок
2: Загальний об'єм реакційного розчину (мл)
0,5: Об’єм розчину ферменту (мл)
0,5: Об’єм реакційної рідини, що використовується для хромогенного визначення (мл)
10: Час реакції (хв)
Df: Багаторазове розведення
C: Концентрація ферменту (мг/мл)
Список літератури
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.біофіз.рез.Комун.(1971);44:513.
3. Гільц Х.та ін.,Євро.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Сембрук Джet ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Цифри
Рис. 1 Оптимальний pH
100мМ буферний розчин: pH6,0-8,0, Na-фосфат;pH8,0-9,0, трис-HCl;pH9,0-12,5, гліцин-NaOH. Концентрація ферменту: 1 мг/мл
Рис. 2 Оптимальна температура
Реакція в 20мМ К-фосфатному буфері рН 8,0.Концентрація ферменту: 1 мг/мл
Рис. 3 pH Стабільність
25 ℃, 16 годин обробка 50 мМ буферним розчином: pH 4,5-5,5, ацетат;pH 6,0-8,0, Na-фосфат;pH 8,0-9,0, трис-HCl.pH 9,0-12,5, Гліцин-NaOH.Концентрація ферменту: 1 мг/мл
Рис. 4 Тепловий стабільність
30-хвилинна обробка 50 мМ Tris-HCl буфером, pH 8,0.Концентрація ферменту: 1 мг/мл
Рис. 5 Зберігання стабільніty at 25℃
