5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Каталожний номер: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) — це високостабільна суміш на основі зонда в одній пробірці, придатна для одноетапної зворотної транскрипції та кількісної ПЛР (qRT-PCR).Він підтримує попереднє змішування праймерів і зондів і залишається стабільним після тривалого зберігання при низькій температурі.Зразок для тестування можна додати безпосередньо під час використання, без додаткового відкриття пробірки/операції піпетування.Цей продукт містить такі компоненти, як ДНК-полімераза гарячого старту, M-MLV, термолабільна урацил ДНК-глікозилаза (TS-UNG), інгібітор РНКази, MgCl2, dNTP (з dUTP замість dTTP) і стабілізатори.За допомогою генетично модифікованої зворотної транскриптази швидкої ампліфікації та ДНК-полімерази можна завершити ПЛР-ампліфікацію протягом 20-40 хвилин.Цей реагент використовує спеціальний буфер для кПЦР зі змішаними ферментами антиінгібіторного ферменту ампліфікації та ферменту UNG.Таким чином, він може отримати хорошу ампліфікацію цільових генів і запобігти помилковій ампліфікації, спричиненій залишковим та аерозольним забрудненням ПЛР.Цей реагент сумісний з більшістю приладів для кількісної ПЛР флуоресценції таких виробників, як Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad і Roche.
компонент
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.Буфер попереднього змішування 5×Neoscript Fast RT (dUTP)
Умови зберігання
Всі компоненти повинні зберігатися при -20 ℃ для тривалого зберігання та 4 ℃ до 3 місяців.Будь ласка, ретельно перемішайте після розморожування та відцентрифугуйте перед використанням.Уникайте частого заморожування-розморожування.
Підготовка реакційної системи qRT-PCR
| компоненти | 25мклсистема | 50мклсистема | Остаточна концентрація |
| Буфер попереднього змішування 5×Neoscript Fast RT (dUTP) | 5 мкл | 10 мкл | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| 25 × Суміш праймер-зондa | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| Матрична РНКb | – | – | – |
| ddH2O | До 25 мкл | До 50 мкл | – |
1) a. Кінцева концентрація праймера зазвичай становить 0,2 мкМ.Для кращих результатів концентрацію праймера можна оптимізувати в межах 0,2-1 мкМ.Як правило, концентрацію зонда можна оптимізувати в діапазоні 0,1-0,3 мкМ.
2) b. У разі використання швидкої процедури ПЛР збільшення концентрації праймерів і зондів може призвести до кращих результатів ампліфікації, і їхнє співвідношення має бути відповідно оптимізовано.
3) Різні типи зразків містять різні типи та вміст інгібітора та кількість копій цільового гена.Обсяг зразка слід враховувати фактичним станом.Якщо необхідно, розведіть зразок водою, що не містить нуклеази, або буфером TE.
Реакція Сумовах
| Регулярна процедура ПЛР | Швидка процедура ПЛР | ||||||
| Процедура | темп. | час | Цикл | Процедура | темп. | час | Цикл |
| Зворотна транскрипція | 50 ℃ | 10-20 хв | 1 | Зворотна транскрипція | 50 ℃ | 5 хв | 1 |
| Полімераза активація | 95 ℃ | 1-5 хв | 1 | Полімераза активація | 95 ℃ | 30-ті роки | 1 |
| Денатурація | 95 ℃ | 10-20с | 40-50 | Денатурація | 95 ℃ | 1-3с | 40-50 |
| Відпал і Розширення | 56-64 ℃ | 20-60-ті роки | Відпал і Розширення | 56-64 ℃ | 3-20с | ||
Контроль якості
1.Виявлення функцій: чутливість, специфічність і повторюваність КПЦР.
2.Відсутність екзогенної нуклеазної активності: відсутність екзогенної ендонуклеази та забруднення екзонуклеазою.
Примітки
1.Швидкість ампліфікації швидкої ДНК-полімерази становить не менше 1 кб/10 с.Різні інструменти для ПЛР мають різні швидкості нагріву та охолодження, режими контролю температури та теплопровідність, тому оптимізація концентрації праймера/зонда та методу роботи в поєднанні з вашим конкретним інструментом для швидкої ПЛР є важливою.
2.Цей продукт має широке застосування та підходить для високочутливої молекулярної діагностики.Триетапний метод ПЛР рекомендований для праймерів з низькою температурою відпалу або для ампліфікації довгих фрагментів понад 200 п.н.
3.Оскільки різні амплікони мають різну ефективність використання dUTP і різну чутливість до UNG, реагенти слід оптимізувати, якщо чутливість виявлення знижується під час використання системи UNG.За потреби зв’яжіться з нами для отримання технічної підтримки.
4.Щоб уникнути ампліфікації залишкових продуктів ПЛР, для ампліфікації потрібні спеціальна експериментальна зона та піпетка.Працюйте в рукавичках, часто міняйте їх і не відкривайте пробірку для ПЛР після ампліфікації.
