Блокуючий фермент вірусу осповакцини

Фермент кепування вірусу коров’ячої віспи походить від рекомбінантного штаму E. coli, що несе гени для кепування ферменту кепки.Цей єдиний фермент складається з двох субодиниць (D1 і D12) і має три ферментативні активності (РНК-трифосфатаза і гуанілілтрансфераза субодиниці D1 і гуанінметилтрансфераза субодиниці D12).Ензим кепування вірусу коров’ячої віспи ефективний для каталізації утворення кеп-структури, яка може специфічно приєднувати 7-метилгуанілатну кеп-структуру (m7Gppp, Cap 0) до 5′-кінця РНК.Структура кеп (Cap 0) відіграє важливу роль у стабілізації мРНК, транспорті та трансляції в еукаріот.Блокування РНК за допомогою ферментативної реакції є ефективним і простим методом, який може значно покращити стабільність і трансляцію РНК для транскрипції, трансфекції та мікроін’єкції in vitro.

компоненти

Блокуючий фермент вірусу осповакцини (10 ОД/мкл)

10×Capping Buffer

Умови зберігання

-25～- 15℃ для зберігання （Уникайте повторних циклів заморожування-розморожування）

Буфер зберігання

20 мМ трис-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl,

1мМ DTT, 0,1мМ EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% гліцерину.

Визначення одиниці

Одна одиниця ферменту кепування вірусу осповакцини визначається як кількість ферменту, необхідного для включення 10 пмоль GTP у 80-ну транскрипт за 1 годину при 37°C.

Контроль якості

екзонуклеаза:10 ОД ферменту кепування вірусу коров’ячої віспи з 1 мкг λ-Hind III розщепленої ДНК при 37 ℃ протягом 16 годин не призводить до розкладання, як визначено електрофорезом у агарозному гелі.

Ендонуклеаза:10 ОД ферменту блокування вірусу коров’ячої віспи з 1 мкг λДНК при 37 ℃ протягом 16 годин не призводить до розкладання, як визначено електрофорезом у агарозному гелі.

Nickase:10 ОД ферменту блокування вірусу коров’ячої віспи з 1 мкг pBR322 при 37 ℃ протягом 16 годин не призводить до розкладання, як визначено електрофорезом у агарозному гелі.

РНКаза:10 ОД ферменту блокування вірусу коров’ячої віспи з 1,6 мкг РНК MS2 протягом 4 годин при 37 ℃ не призводить до розкладання, як визначено електрофорезом у агарозному гелі.

1.coli ДНК:10 ОД ферменту кепування вірусу осповакцини перевіряють на наявність геномної ДНК E. coli за допомогою кПЛР TaqMan з праймерами, специфічними для локусу 16S рРНК E. coli.Забруднення геномної ДНК E. coli становить ≤1 генома E. coli.

2.бактеріальний Ендотоксин: LAL-тест, відповідно до Китайської Фармакопеї IV 2020 видання, метод тестування межі гелю, загальне правило (1143).Вміст бактеріального ендотоксину має бути ≤10 EU/мг.

Система та умови реакції

1. Протокол кепування (об’єм реакції: 20 мкл)

Ця процедура застосовна до реакції блокування 10 мкг РНК (≥100 нт), і її можна збільшити відповідно до експериментальних вимог.

I) Змішайте 10 мкг РНК і воду без нуклеази в мікроцентрифужній пробірці на 1,5 мл до кінцевого об’єму 15,0 мкл.*10× Буфер для блокування: 0,5 М трис-HCl, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Нагрійте при 65 ℃ протягом 5 хвилин, потім на крижаній бані протягом 5 хвилин.

3) Додайте наступні компоненти у вказаному порядку

*10 × Буфер для блокування: 0,5 М трис-HCl, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, (25 ℃, рН 8,0)

4) Інкубуйте при 37°C протягом 30 хвилин, тепер РНК закрита та готова до подальшого застосування.

2. 5′ термінал реакція маркування (обсяг реакції: 20 мкл)

Цей протокол призначений для мічення РНК, що містить 5´ трифосфат, і його можна збільшити відповідно до вимог.На ефективність включення мітки впливатиме молярне співвідношення РНК: GTP, а також вміст GTP у зразках РНК.

1) Змішайте відповідну кількість РНК і води, що не містить нуклеази, у мікроцентрифужній пробірці на 1,5 мл до кінцевого об’єму 14,0 мкл.

2) Нагрійте при 65 ℃ протягом 5 хвилин, потім на крижаній бані протягом 5 хвилин.

3) Додайте наступні компоненти у вказаному порядку.

** GTP MIX відноситься до GTP і невеликої кількості маркерів.Концентрацію GTP дивдо Примітки 3.

4) Інкубуйте при 37°C протягом 30 хвилин, кінець 5' РНК тепер позначений і готовий для подальшого руху

Додатки

1. Кепування мРНК перед аналізами трансляції/трансляції in vitro

2. Позначення 5´ кінця мРНК

Примітки щодо використання

1.Нагрівання розчину РНК перед інкубацією з ферментом кепування коров’ячої віспи видаляє вторинну структуру на 5´-кінці транскрипту.Збільште час до 60 хвилин для транскриптів із відомими високоструктурованими 5´-кінцями.

2. РНК, яка використовується для реакцій блокування, повинна бути очищена перед використанням і суспендована у воді, вільній від нуклеаз.EDTA не повинна бути присутня, і розчин не повинен містити солі.

3. Для мічення 5´-кінця загальна концентрація GTP повинна бути приблизно в 1-3 рази більшою за молярну концентрацію мРНК у реакції.

4. Об’єм реакційної системи можна збільшити або зменшити відповідно до фактичного.