PNGase F
Пептид-N-глікозидаза F (PNGase F) є найефективнішим ферментативним методом для видалення майже всіх N-зв'язаних олігосахаридів з глікопротеїнів.PNGase F є амідазою, яка розщеплює між внутрішніми залишками GlcNAc і аспарагіну гібридні та складні олігосахариди з N-пов’язаними глікопротеїнами з високим вмістом манози.
застосування
Цей фермент корисний для видалення залишків вуглеводів з білків.
Підготовка та специфікація
| Зовнішній вигляд | Безбарвна рідина |
| Чистота білка | ≥95% (з SDS-PAGE) |
| діяльність | ≥500 000 Од/мл |
| Екзоглікозидаза | Жодної активності не виявлено (ND) |
| Ендоглікозидаза F1 | ND |
| Ендоглікозидаза F2 | ND |
| Ендоглікозидаза F3 | ND |
| Ендоглікозидаза H | ND |
| Протеаза | ND |
Властивості
| номер EC | 3.5.1.52(Рекомбінант з мікроорганізму) |
| Молекулярна вага | 35 кДа (SDS-PAGE) |
| Ізоелектрична точка | 8. 14 |
| Оптимальний pH | 7,0-8,0 |
| Оптимальна температура | 65 °C |
| Субстратна специфічність | Розщеплення глікозидних зв'язків між GlcNAc і залишками аспарагіну Рис.1 |
| Сайти розпізнавання | N-пов’язані глікани, якщо вони не містять α1-3 фукозу (рис. 2). |
| активатори | DTT |
| інгібітор | SDS |
| Температура зберігання | -25 ~ -15 ℃ |
| Теплова інактивація | 20 мкл реакційної суміші, що містить 1 мкл PNGase F, інактивують інкубацією при 75 °C протягом 10 хвилин. |
Рис. 1 Субстратна специфічність PNGase F
Рис. 2 Місця розпізнавання PNGase F.
Коли внутрішні залишки GlcNAc пов’язані з α1-3 фукозою, PNGase F не може відщеплювати N-пов’язані олігосахариди від глікопротеїнів.Ця модифікація поширена в глікопротеїнах рослин і деяких комах.
Cкомпоненти
|
| компоненти | Концентрація |
| 1 | PNGase F | 50 мкл |
| 2 | 10 × глікопротеїновий денатуруючий буфер | 1000 мкл |
| 3 | 10×Глікобуфер 2 | 1000 мкл |
| 4 | 10% НП-40 | 1000 мкл |
Визначення одиниці
Одна одиниця (U) визначається як кількість ферменту, необхідного для видалення >95% вуглеводів з 10 мкг денатурованої РНКази B за 1 годину при 37°C у загальному реакційному об’ємі 10 мкл.
Умови реакції
1. Розчиніть 1-20 мкг глікопротеїну з деіонізованою водою, додайте 1 мкл 10× буфера для денатурації глікопротеїну та H2O (якщо необхідно), щоб отримати 10 мкл загального об’єму реакції.
2.Інкубуйте при 100 °C протягом 10 хвилин, охолодіть на льоду.
3.Додайте 2 мкл 10×GlycoBuffer 2, 2 мкл 10% NP-40 і перемішайте.
4.Додайте 1-2 мкл PNGase F і H2O (якщо необхідно), щоб отримати 20 мкл загального об’єму реакції та перемішати.
5.Інкубуйте реакцію при 37°C протягом 60 хв.
6.Для аналізу SDS-PAGE або аналізу ВЕРХ.
