мРНК Cap2'-O-Метилтрансфераза

мРНК Cap 2´-O-метилтрансферази була отримана з рекомбінантного штаму E. coli, який несе ген мРНК Cap 2´-O-метилтрансферази коров'ячої віспи.Цей фермент додає метильну групу в положенні 2´-O першого нуклеотиду поруч із кеп-структурою на 5-кінці РНК. Фермент використовує S-аденозилметіонін (SAM) як донор метилу для метилювання кепованої РНК (кеп -0), що призводить до структури cap-1.

Структура Cap1 може збільшити ефективність трансляції, покращуючи експресію мРНК в експериментах з трансфекцією та мікроін’єкціями. Для цього ферменту в якості субстрату особливо потрібна РНК із кепкою m7GpppN.Він не може використовувати РНК з pN, ppN, pppN або GpppN на 5' кінці.Кепована РНК може бути отримана за допомогою транскрипції in vitro з використанням кеп-аналогу або шляхом ферментативного кепування з використанням кеп-ферменту коров’ячої віспи.

компоненти

мРНК Cap 2´-O-метилтрансфераза (50U/мкл)

10×Capping Reaction Buffer

Зберігання

-25 ～- 15 ℃ для зберігання （ Уникайте повторних циклів заморожування-розморожування）

Буфер зберігання

20 мМ Tris-HCl（pH 8,0，25℃), 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,1 мМ EDTA, 0,1 % Triton X-100， 50 % гліцерину.

Визначення одиниці

Одна одиниця визначається як кількість ферменту, необхідного для метилювання 10 пмоль транскрипту РНК із 80 нуклеотидними кепками за 1 годину при 37°C.

Контрольні аналізи якості

Екзонуклеаза:50U мРНК Cap 2´-O-метилтрансферази з 1 мкг λ-Hind III розщепленої ДНК при 37 ℃ протягом 16 годин не призводить до розкладання, як визначено електрофорезом у агарозному гелі.

Ендонуклеаза: 50 ОД мРНК Cap 2´-O-метилтрансферази з 1 мкг λДНК при 37 ℃ протягом 16 годин не призводить до розкладання, як визначено електрофорезом у агарозному гелі.

Nickase: 50 ОД мРНК Cap 2´-O-метилтрансферази з 1 мкг pBR322 при 37 ℃ протягом 16 годин не призводить до розкладання, як визначено за допомогою електрофорезу в агарозному гелі.

РНКаза: 50 ОД мРНК Cap 2´-O-метилтрансферази з 1,6 мкг MS2 РНК протягом 4 годин при 37 ℃ не призводить до розкладання, як визначено за допомогою електрофорезу в агарозному гелі.

E. кишкова паличка ДНК: 50U мРНК Cap 2´-O-метилтрансферази перевіряють на наявністьE. кишкова паличка геномної ДНК за допомогою кПЛР TaqMan з праймерами, специфічними дляE. кишкова паличка Локус 16S рРНК.TheE. кишкова паличка контамінація геномної ДНК =1E. кишкова паличка геном.

бактеріальний Ендотоксин: LAL-тест, відповідно до китайської фармакопеї IV 2020 видання, метод тестування межі гелю, загальне правило (1143).Вміст бактеріального ендотоксину повинен бути =10 EU/мг.

Система та умови реакції

1. Змішайте відповідну кількість закритої РНК і води, вільної від РНКази, у 1,5 мл мікроцентрифужній пробірці до кінцевого об’єму 16,0 мкл.

2. Нагрійте при 65 ℃ протягом 5 хвилин, а потім 5 хвилин на крижаній бані.

3. Додайте наступні компоненти у зазначеному порядку (для метилювання кепованої РНК

менше 10

*10× буфер реакційного блокування: 500 мМ трис-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT.

4. Інкубуйте при 37 ℃ протягом 1 години (рекомендується 2 години інкубації для цільового фрагмента менше 200 нт).

Додатки

Для покращення експресії мРНК під час експериментів з мікроін’єкціями та трансфекцією.

Примітки щодо використання

1. Перед реакцією РНК слід очистити та розчинити у воді без нуклеаз, усі розчини не повинні містити EDTA та іонів.

2. Рекомендується нагрівати зразок РНК при 65 ℃ протягом 5 хвилин перед реакцією, щоб видалити вторинну структуру на 5´-кінці транскрипту.Його можна подовжити до 10 хв для складної 5´-кінцевої структури.