Дволанцюгова РНК (dsRNA) ELISA KIT

Цей набір являє собою імуноферментний аналіз (ELISA), який поєднується з системою біотин-стрептавідин, для кількісного вимірювання дцРНК довжиною понад 60 пар основ (bp), незалежно від послідовності.Планшет був попередньо покритий антитілом проти дцРНК.dsRNA, присутня у зразку, додається та зв’язується з антитілами, покритими лунками.Потім додається біотинільоване антитіло проти дцРНК, яке зв’язується з дцРНК у зразку.Після промивання додається HRP-стрептавідин, який зв’язується з біотинільованим антитілом до дцРНК.Після інкубації незв'язаний HRP-Streptavidin змивається.Потім додається розчин субстрату TMB і каталізується HRP для отримання синього кольору продукту, який змінився на жовтий після додавання кислого стоп-розчину.Щільність жовтого кольору пропорційна цільовій кількості дцРНК, захопленої планшетом.Поглинання вимірюється при 450 нм.

застосування

Цей набір призначений для кількісного вимірювання залишкової дцРНК.

Компоненти набору

Зберігання та стабільність

1. Для невикористаного набору: весь набір можна зберігати при 2~8 ℃ протягом терміну придатності.Для стабільності зберігання слід уникати сильного світла.

2. Для використаного набору: після відкриття мікропланшета закрийте невикористані лунки герметиком для планшетів і поверніть його в пакет із фольгою, що містить пакет із осушувачем, закрийте пакет із фольги та поверніть його до 2~8 ℃ якомога швидше після використання.Інші реагенти слід повернути до 2~8 ℃ якомога швидше після використання.

Необхідні матеріали, але не надаються

1. Зчитувач мікропланшетів із фільтром 450±10 нм (краще, якщо можна детектувати на довжині хвилі 450 та 650 нм).

2. Шейкер для мікропланшетів.

3. Наконечники та центрифужні пробірки без РНКаз.

Блок-схема операції

Перед тим як ти почнеш

1. Перед використанням доведіть усі компоненти набору та зразки до кімнатної температури (18-25 ℃).Якщо набір не буде використано за один раз, вийміть лише смужки та реагенти для цього експерименту, а решту смужок і реагентів залиште в потрібному стані.

2. Промивний буфер: розведіть 40 мл 20× концентрованого промивного буфера 760 мл деіонізованої або дистильованої води, щоб приготувати 800 мл 1× промивного буфера.

3. Стандарт: короткочасно відкрутіть або відцентрифугуйте базовий розчин перед використанням.Концентрація чотирьох наданих стандартів становить 5 нг/мкл.Для стандартів UTP і pUTP dsRNA розведіть базовий розчин до 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 пг/мкл буфером STE, щоб намалювати стандартну криву.Для стандартів дцРНК N1-Me-pUTP розведіть базовий розчин до 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0 пг/мкл буфером STE, щоб намалювати стандартну криву.Для стандарту 5-OMe-UTP dsRNA розведіть основний розчин до 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0 пг/мкл буфером STE, щоб намалювати стандартну криву.Ми рекомендуємо, щоб стандарти можна розводити за такими діаграмами:

4. Біотинільоване антитіло для виявлення та робочий розчин HRP-стрептавідину: ненадовго відкрутіть або відцентрифугуйте основний розчин перед використанням.Розведіть їх до робочої концентрації буфером для розведення.

5. Субстан TMB: аспіруйте необхідну дозу розчину за допомогою стерилізованих наконечників і не виливайте залишковий розчин знову у флакон.Субстрат TMB чутливий до світла, не піддавайте субстрат TMB дії світла протягом тривалого часу.

Використання протоколу

1. Визначте кількість смужок, необхідних для аналізу.Вставте смуги в рамки для використання.Решту смужок планшетів, які не використовувалися в цьому аналізі, слід повторно запакувати в пакет із осушувачем.Щільно закрийте пакет для зберігання в холодильнику.

2. Додайте по 100 мкл кожного розведення стандарту, холостого зразка та зразків у відповідні лунки.Накрийте герметиком для пластин.Інкубуйте протягом 1 години при кімнатній температурі зі струшуванням при 500 об/хв.Зразки слід розвести буфером STE до відповідної концентрації для точного аналізу.

3. Етап промивання: аспіруйте розчин і промийте 250 мкл промивного буфера в кожну лунку та дайте йому постояти протягом 30 секунд.Повністю викиньте промивний буфер, поклавши пластину на абсорбуючий папір.Загальне прання 4 рази.

4. Додайте 100 мкл робочого розчину біотинільованих антитіл для виявлення в кожну лунку.Накрийте герметиком для пластин.Інкубуйте протягом 1 години при кімнатній температурі зі струшуванням при 500 об/хв.

5. Повторіть крок прання.

6. Додайте 100 мкл робочого розчину HRP-стрептавідину в кожну лунку.Накрийте герметиком для пластин.Інкубуйте протягом 30 хвилин при кімнатній температурі зі струшуванням при 500 об/хв.

7. Повторіть крок прання ще раз.

8. Додайте 100 мкл розчину субстрату ТМВ у кожну лунку.Накрийте герметиком для пластин.Інкубуйте протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Захищайте від світла.При додаванні розчину субстрату рідина стане синьою.

9. Додайте 50 мкл стоп-розчину в кожну лунку.При додаванні стоп-розчину рідина стане жовтою.Потім запустіть зчитувач мікропланшетів і негайно проведіть вимірювання при 450 нм.

Підрахунок результатів

1. Усередніть повторні показання для кожного стандарту, контролю та зразків і відніміть середнє значення нульової стандартної оптичної густини.Побудуйте стандартну криву з абсорбцією на вертикальній (Y) осі та концентрацією дцРНК на горизонтальній (X） осі.

2. Рекомендується виконувати розрахунок за допомогою комп’ютерного програмного забезпечення для підгонки кривої, такого як curve expert 1.3 або ELISA Calc, у моделі нелінійної підгонки з 5 або 4 параметрами.

Продуктивність

1. Чутливість:

нижня межа виявлення: ≤ 0,001 пг/мкл (для UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/мкл (для 5-OMe-UTP-dsRNA).

нижня межа кількісного визначення: 0,0156 пг/мкл (для UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 пг/мкл (для N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 пг/мкл (для 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Точність: CV внутрішнього аналізу ≤10%, CV внутрішнього аналізу ≤10%

3. Відновлення: 80%~120%

4. Лінійність: 0,0156-0,5 пг/мкл (для UTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/мкл (для N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/мкл (для 5-OMe-UTP-dsRNA).

міркування

1. Температура та час реакції TMB є критичними, будь ласка, контролюйте їх строго відповідно до інструкцій.

2. Щоб досягти гарної відтворюваності та чутливості аналізу, необхідним є правильне промивання планшетів для видалення надлишку реагентів, що не прореагували.

3. Усі реагенти слід ретельно перемішати перед використанням і уникати утворень під час додавання зразка або реагентів.

4. Якщо в концентрованому буфері для промивання (20x) утворилися кристали, нагрійте його до 37 ℃ і обережно перемішайте, поки кристали повністю не розчиняться.

5. Уникайте аналізу зразків, що містять азид натрію (NaN3), оскільки він може зруйнувати активність HRP, що призведе до недооцінки кількості дцРНК.

6. Уникайте контамінації РНКази під час аналізу.

7. Стандарт/зразок, антитіла для виявлення та SA-HRP також можна проводити при кімнатній температурі без струшування, але це може спричинити зниження чутливості виявлення в один раз.Для цього випадку ми рекомендуємо, щоб стандарти дцРНК UTP і pUTP розводили з 2 пг/мкл, стандарти дсРНК N1-Me-pUTP слід розводити з 4 пг/мкл, а стандарт дсРНК 5-OMe-UTP слід розводити з 8 пг/мкл.Крім того, інкубуйте робочий розчин HRP-стрептавідину протягом 60 хвилин при кімнатній температурі.Не використовуйте шейкер для колб, оскільки шейкер для колб може призвести до неточних результатів.

Типовий результат

1. Дані стандартної кривої

2. Розрахунок стандартної кривої

3. Діапазон виявлення вкладишів: 0,0312-1 пг/мкл